生物问题:差速离心法

【专家解说】：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。 沉降系数(sedimentation coefficient) 用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度。或s=v/ω2r。s是沉降系数，ω是离心转子的角速度(弧度/秒)，r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为1~200×10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S，即1S=10-13秒，如血红蛋白的沉降系数约为4×10-13秒或4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。 沉降系数(sedimentation coefficient, s) 的测定原理与方法 沉降系数(sedimentation coefficient，s) 根据1924年Svedberg(离心法创始人--瑞典蛋白质化学家)对沉降系数下的定义:颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。 To call the parameter which characterizes the movement of the particle at the centrifugal force place。 沉降系数是以时间表示的。 蛋白质，核酸等生物大分子的S实际上时常在10-13秒左右，故把沉降系数10 -13 秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。 [ Adopted unit ] second [ Another unit ] 1 svedberg = 1E(-13) sec [ SI unit ] second 因随溶剂的种类、温度的变化而变化，所以通常是换算成20℃纯水中的数值，进一步算出分子间无作用力和浓度为零时的外插值。沉降系数是以分子量、分子形状和水等情况来决定，其作为生物体大分子的一个特征是很重要的。 沉降系数的测定 沉降系数通过分析离心机测定。 通常只需要几十毫克甚至几十微克样品，配制成1~2毫升溶液，装入分析池，以几小时的分析离心，就可以获得一系列的样品离心沉降图。根据沉降图可以作样品所含组分的定性分析，亦可以测定各组分的沉降系数和估计分子大小，作样品纯度检定和不均一性测定，以组分的相对含量测定。 沉降系数的测定原理 沉降系数的测定原理就是在恒定的离心力场下测定样品颗粒的沉降速度。 因为样品颗粒很小，不能直接看到它们的沉降运动，所以把离心时样品颗粒的界面移动速度看作是样品颗粒的平均沉降速度。通常使用Schlieren和吸收光学系统来记录界面沉降图。在沉降图中样品界面一般表现为一个对称的峰，峰的最高点代表界面位置。(图) 通常沉降系数测量精度为±2%,但是如果面界图型表现为不对称峰型，或希望沉降系数测量精度达到±1%或更小的情况时，按峰的最高点作为界面位置就不够了这时应该使用二阶距法计算界面位置。 基本原理 物体围绕中心轴旋转时会受到离心力F的作用。当物体的质量为 M、体积为V、密度为D、旋转半径为r、角速度为ω(弧度数/秒)时，可得: F=Mω2r 或者 F=V.D.ω2r (1) 上述表明:被离心物质所受到的离心力与该物质的质量、体积、密度、离心角速度以及旋转半径呈正比关系。离心力越大，被离心物质沉降得越快。 在离心过程中，被离心物质还要克服浮力和摩擦力的阻碍作用。浮力F}和摩擦力F}}分别由下式表示: F’=V.D’.ω2r (2) F’’=f dr/dt (3) 其中D}为溶液密度，f为摩擦系数，dr/dt为沉降速度(单位时间内旋转半径的改变)。 基本原理 在一定条件下，可有 : F=F’+F’’ V.D. ω2r =V.D’ω2r + f. dr/dt dr/dt =Vω2r (D-D’)/f (4) 式(4)表明，沉降速度与被离心物质的体积、密度差呈正比，与f成反比。若以S表示单位力场(ω2r=1)下的沉降速度，则 S=V (D-D’)/f S即为沉降系数。 沉降系数对于生物大分子来说，多数在(1~500)×10-13秒之间。为应用方便起见，人们规定1×10-13秒为一个单位(或称1S)。一般单纯的蛋白质在1~20S之间，较大核酸分 子在4~100S之间，更大的亚细胞结构在30~500S之间。 以蛋白质为例 溶液中的蛋白质在受到强大的离心作用时，如果蛋白质溶液的密度大于溶剂的密度，蛋白质分子就会下沉，在离心场中，蛋白质分子所受到的净离心力(离心力减去浮力)与溶剂的摩擦力平衡时，每单位离心场强度定值，这个定值即为沉降系数(sedimentation coefficient)。沉降速度用每单位时间内颗粒下沉的距离来表示。 测定方法: ⑴样品:蛋白质 ⑵样品溶液与离心:将样品溶于缓冲液中，用一定规格的双槽分析池，一边加入溶液一边加入溶剂。分析池与平衡池平衡重量，使平衡池比分析池轻0.5g以内，然后分别装入分析转头。抽真空。开Schlieren光光源，选择工作速度，室温离心。转动腔达到真空后离以机开始运转加速，此时在观察窗口可以看到离心图型。达到工作速度后恒速离心。 以蛋白质为例 待看到样品峰的尖端后即可以间隔照相。照完相即可关机，取出样品液，清理转头和分析池。照相用强反差显影冲洗后即得Schlieren光路沉降图形照片。 ⑶沉降图像测量:Schlieren沉降图可以用比长仪，读数显微镜，或投影仪测量。测量时把沉降图像的底片放于测量仪器上，使液面的垂直线与测量仪中的垂直线重合，然后用十字标线依次测量内参孔，液面，界面峰尖，和外参考孔的位置，每个图像至少读测三次，取平均值。依次把每个图像依同样方法测量，把数据列成表。 (4)沉降系数S的计算:代入公式计算。 离心图像的分析 当离心刚开始时如果见到有快速沉降的峰，几分钟内就到达分析池底部，一般多是由于样品发生部分聚合形成快速沉降的高聚物。离心达速后样品的的记心图像显示一个对称的峰形，一般可以认为样品是离心均一的。但是对样品的真正均一性还应用其他方法进一步检测，如电泳，层析等。某些混合样品偶然亦会给出一个对称峰的。峰形通常会随时间而扩展，这是由于样品扩散的结果。但如果峰形扩展很快，则该样品可能是多分散性的。如果离心图像中表现几个峰，说明样品中有几个组分，每一个峰代表相应组分的沉降界面，因此可以测定每一个组分的沉降系数值。根据峰的面积可以测量组分的浓度值。 有时离心的图像表现出一个不对称的峰，这可能是由于下列几种情况所致。①几个沉降系数接近的组分峰形重叠，②样品是多分散性的，其分子量分布不均匀，③某些相互作用强的高分子，其沉降速度对浓度依赖很大。若测定于高浓度，在界面区由于浓度变化造成沉降速度不一致而致峰形呈不对称分布