如何用同位素标记化合物

【专家解说】：同位素示踪法 放射性同位素的应用-同位素示踪法 同位素示踪法(isotopic tracer method)是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法，示踪实验的创建者是Hevesy。Hevesy于1923年首先用天然放射性212Pb研究铅盐在豆科植物内的分布和转移。继后Jolit和Curie于1934年发现了人工放射性，以及其后生产方法的建立(加速器、反应堆等)，为放射性同位素示踪法的更快的发展和广泛应用提供了基本的条件和有力的保障。 一、同位素示踪法基本原理和特点 同位素示踪所利用的放射性核素(或稳定性核素)及它们的化合物，与自然界存在的相应普通元素及其化合物之间的化学性质和生物学性质是相同的，只是具有不同的核物理性质。因此，就可以用同位素作为一种标记，制成含有同位素的标记化合物(如标记食物，药物和代谢物质等)代替相应的非标记化合物。利用放射性同位素不断地放出特征射线的核物理性质，就可以用核探测器随时追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变等，稳定性同位素虽然不释放射线，但可以利用它与普通相应同位素的质量之差，通过质谱仪，气相层析仪，核磁共振等质量分析仪器来测定。放射性同位素和稳定性同位素都可作为示踪剂(tracer)，但是，稳定性同位素作为示踪剂其灵敏度较低，可获得的种类少，价格较昂贵，其应用范围受到限制;而用放射性同位素作为示踪剂不仅灵敏度，测量方法简便易行，能准确地定量，准确地定位及符合所研究对象的生理条件等特点: 1.灵敏度高 放射性示踪法可测到10-14-10-18克水平，即可以从1015个非放射性原子中检出一个放射性原子。它比目前较敏感的重量分析天平要敏感108-107倍，而迄今最准确的化学分析法很难测定到10-12克水平。 2.方法简便 放射性测定不受其它非放射性物质的干扰，可以省略许多复杂的物质分离步骤，体内示踪时，可以利用某些放射性同位素释放出穿透力强的r射线，在体外测量而获得结果，这就大大简化了实验过程，做到非破坏性分析，随着液体闪烁计数的发展，14C和3H等发射软β射线的放射性同位素在医学及生物学实验中得到越来越广泛的应用。 3.定位定量准确 放射性同位素示踪法能准确定量地测定代谢物质的转移和转变,与某些形态学技术相结合(如病理组织切片技术，电子显微镜技术等)，可以确定放射性示踪剂在组织器官中的定量分布，并且对组织器官的定位准确度可达细胞水平、亚细胞水平乃至分子水平。 4.符合生理条件 在放射性同位素实验中，所引用的放射性标记化合物的化学量是极微量的，它对体内原有的相应物质的重量改变是微不足道的，体内生理过程仍保持正常的平衡状态，获得的分析结果符合生理条件，更能反映客观存在的事物本质。 放射性同位素示踪法的优点如上所述，但也存在一些缺陷，如从事放射性同位素工作的人员要受一定的专门训练，要具备相应的安全防护措施和条件，在目前个别元素(如氧、氮等)还没有合适的放射性同位素等等。在作示踪实验时，还必须注意到示踪剂的同位素效应和放射效应问题。所谓同位素效应是指放射性同位素(或是稳定性同位素)与相应的普通元素之间存在着化学性质上的微小差异所引起的个别性质上的明显区别，对于轻元素而言，同位素效应比较严重。因为同位素之间的质量判别是倍增的，如3H质量是1H的三倍，2H是1H的两倍，当用氚水(3H2O)作示踪剂时，它在普通H2O中的含量不能过大，否则会使水的物理常数、对细胞膜的渗透及细胞质粘性等都会发生改变。但在一般的示踪实验中，由同位素效应引起的误差，常在实验误差内，可忽略不计。放射性同位素释放的射线利于追踪测量，但射线对生物体的作用达到一定剂量时，会改变机体的生理状态，这就是放射性同位素的辐射效应，因此放射性同位素的用量应小于安全剂量，严格控制在生物机体所能允许的范围之内，以免实验对象受辐射损伤，而得错误的结果。 二、示踪实验的设计原则 设计一个放射性同位素的示踪实验应从实验的目的性，实验所具备的条件和对放射性的防护水平三方面着手考虑。原则上必须从两个主要方面来设计放射性示踪实验:一是必须寻求有效的、可重复的测定放射性强度的条件，二是必须选择一个合适的比活度λqδ(单位是原子/时间/分子，dpm/mol或ci/mol)。其中，λ=-dN’dt/N’为该处放射性原子核的衰变常数。q=N ’/n’，表示n’个该化学形式分子为N’个放射性原子所标记。δ=n’/n表示放射性标记的分子数n’与总分子数(标记的加未标记的)n之比。采用放射性同位素示踪技术来实现所研究课题预期目的全部或一部分，一般须经过实验准备阶段，实验阶段和放射性废物处理三个步骤。 (一)实验准备阶段 1.示踪剂的选择 选定放射性示踪剂的比活度λqδ的值必须足够大，以保证实验所需要的灵敏度，而又要尽可能地小，使得在该实验条件下辐射自分解可忽略。一般情形是根据实验目的和实验周期长短，来选择具有合适的衰变方式，辐射类型和半衰期，且放射毒性低的放射性同位素。至今已确定的放射性核素包括天然的58种和人工制造的约1300种，其中大多数不常能用作放射性示踪剂。主要原因是制备困难、半衰期不合适及放射性不足以定量。在任何一种生产方法中，生产步骤很可能包含或多或少的化学处理，因而示踪实验人员需要了解某个核素及其周围的那些元素的化学性质，因为它们有可能成为此放射性同位素的杂质。 放射性同位素都衰变(经过或不经过中间状态)到处于基态的子体核素，衰变时伴随各种形式的能量辐射，如α、β-、β+、γ、X放射等。在选择示踪剂时，示踪实验人员要仔细研究衰变纲图，根据实验条件和计数条件来决定那一种辐射，在衰变纲变内，代表核能级的两条水平线之间和距离表示能量差，↑或↓表示能级同伴随原子序数增或减少的能量，↓表示从激发态至基态的同质异能跃迁。一般要选择最适宜的半衰期τ的放射性同位素，使τ足够长，从而使衰变校正有意义或干脆不必作衰变校正，同时又要足够短，能较安全地进行示踪实验，并使得放射性废物容易处理，在实际工作中，使用的放射性同位素的半衰期应该与实验需要持续的时间t相适应，如对于某个实验，t/τ=0.04时，应所选放射性同位素的衰变校正为3.5%;而t/τ=0.10时，应选放射性同位素的衰变校正为6.6%。t/τ=0.15时，应选用其衰变校正为10%。 在体外示踪条件，一般选用半衰期较长而射线强度适中，既利于探测，又易于防护和保存的放射性示踪剂。体内示踪条件下，若实验周期短，应选用半衰期短，且能放出一定强度r射线物放射性同位素，若实验周期长，如需要将动物活杀后对组织脏器分别测定的，则应选用半衰期较长放射性同位素。此外，根据实验目的来选用定位的或不定位的标记示踪剂，例如研究氨基酸的脱羧反应，14C应标记在羧基上，只有这种定位标记的氨基酸，才能在脱羧后产生14CO2。而有些实验不要求特定位置标记，只须均匀标记即可。 选择放射性示踪剂还必须同时满足高化学纯度，高放射性核纯度的要求。在示踪剂制备期间、贮存期间以用试验体系中所使用的溶剂、化学试剂、酶等可能会产生化学杂质、放射化学杂质及辐射自分解引起的放射性杂质，这些杂质的存在，使得示踪实验中使用的示踪剂不“纯”，而或多或少影响实验的结果，甚至会导致错误结论。 氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)和尿嘧啶核苷(3H-UR)是两种常用的示踪剂，前者有效地结合到DNA中，后者则掺入到RNA中，它们的辐射分解速度随比较放射性的增高及保存时间的延长而增加，在不同温度和不同溶液中的稳定性也不同。经保存八年的3H-TdR约有35%辐射分解为3H-胸腺嘧啶，并导致二醇和水合物的形式，在实验中这杂质会很快掺入细胞并与大分子(很可能是蛋白质)结合，而不是与DNA和RNA相结合，这些杂质用DNA酶和RNA酶处理细胞都不除去。3H-TdR和3H-UR贮存在-20℃的冷冻溶液中辐射分离速度要比+2℃增加3-4倍，但低温度(-140℃)对贮存也有利，在允许对示踪实验人员在选择保存放射性示踪剂时会有所启发。 2.放射性同位素测量方法的选择 测量方法的选择取决于射线种类，对于α射线通常可用硫化锌晶体、电离室、核乳胶等方法探测;对能量高的β射线可用云母窗计数管、塑料闪烁晶体及核乳胶测定，对于能量低的β射线可用液体闪烁计数器测量:对于γ射线则用G-M计数管，碘化钠(铊)闪烁晶体探测。目前大多数实验室主要采用晶体闪烁计数法和液体闪烁计数法两种测量方式。 同一台探测仪器对不同量的示踪剂具有不同的最佳工作条件，在实验准备阶段要检查探测器是否已调有所用示踪同位素的工作条件，否则需要用一定量的示踪剂作为放射源(或选用该同位素的标准源)，把探测器的最佳工作条件调整好，并且要保证探测器性能处于稳定可靠的状态。 探测最佳工作条件的选择方法:一种是测“坪曲线”，另一种是找最好的品质因素。对于光电倍增管，在理论上不存在“坪”(plateau)。但随着高压的增加，在一定范围内，脉冲数变化较小，形成一段坡度较小的电压脉冲曲线，通常也称其为坪。测坪曲线的方法:固定放射源，根据其射线能量的大小，初选 一个广大器增益(放大倍数)和甄别器阈值。不断地改变高压(由低到高，均匀增加伏度)，每改变一次高压，都测定一次本底和放射源的计数率，最后作出高压本底计数率和高压放射源计数曲线。用同样的方法，作另一个甄别阈值(放大倍数不变)下的高压计数率曲线，这样反复多作几条曲线。必要时，还可固定甄别阈值，改变放大倍数，求出高压计数率曲线。应选择“坪”比较平坦的曲线工作条件:甄别阈值和放大增益，作为正式测定时间的仪器工作条件，高压值应选择在该“坪”中点偏向起始段一边相应的高压值。品质因素，又称为优值，是指在一定条件下，要达到合适的统计数目所需要的时间是仪器的计数效率E和本底计数Nb的函数: 品质因素F=E2/Nb它是衡量一台计数器性能的指标，仪器的品质因素F应该越大越好，品质因素F越大，表示测量效率E越高而本底Nb越小。如果某放射性示踪的标准源存在来源困难等问题的话，可以用相对品质因素f来代替。 相品质因素f=ns/nb 式中ns指某种放射性样品的计数率。找最好品质因素的方法与测坪曲线一样，作出几条高压-F(或f)的关系曲线，在几条曲线中选择峰值最高的曲线。这根曲线的峰值所对应的条件:高压，甄别阈，放大倍数等，就是该仪器对被测同位素的最佳工作条件。最佳品质因素不一定恰好落在“坪”上，有的在“坪”附近，有的却在“坪”的下端。着眼于把同位素的整个能谱峰都计下来的示踪实验者主张取“坪”所对应的工作条件，而着眼于优值者，主张取最佳品质因素所对应的工作条件，也有人折衷。如果某仪器本底很低，光电倍增管噪音很低和能谱分辩高，二者应该相差不大。同一台仪器的最佳工作条件，随仪器的使用期延长而有所改变，不同的放射性同位素，其最佳工作条件不同。因此核探测仪器的最佳工作条件具有专属性，并且要经常通过选择其不同时期的最佳工作条件。更不能不问被测同位素的种类，而千篇一律地使用同一个工作条件。 为了达到准确地计数，可以长时间一次计数，或短时间多次测量，两者达到的标准误基本相同，为避免外界因素的影响，在实际工作中，取短时间多次测量较为合理适用。在测量样品的放射性时，本底是一个重要影响因素。本底高，则标准误和标准误差都增大，尤其在样品计数较低时，本底对标准误和标准误差的影响就愈大，从而影响实验结果的精度，而且为了达到一定的精度，势别要增加样品的测量时间。根据核衰变的统计规律，在实验中如果样品数量少，选择tN=1.4tb的比例(式中tN为样品放射性测量时间，tb为本底测量时间)较为合理;如果样品数量较多是一大批样品，则延长本底测量时间tb，取tb的时间均值，而tN则可相对短，这样可节省时间，有利于缩短实验周期。对于示踪实验设计来说，样品中所含放射性强度的要求，是使其放射性计数率大于或等于本底计数的10-20倍。 3.进行非放射性的模拟实验，把实验全过程预演一遍 同位素示踪实验要求准确、仔细，稍有疏忽或考虑不周就匆忙进行正式实验，既容易导致实验失败，又会造成示踪剂和其它实验用品的浪费，还会增加放射性废物，增加实验室本底水平，使实验者接受不必要的辐射剂量，所以模拟实验不仅可以检查正式实验中所用器材，药品是否合格，又可以操作人员进行训练，以保证正式实验能顺利进行。 (二)正式实验阶段 1.选择放射性同位素的剂量 同位素必须能经得起稀释，使其最后样品的放射性不能低于本底，一般来说放射性同位素在生物体内不是完全均匀地被稀释，可能在某些器官、组织、细胞、某些分子中有选择性地蓄积，蓄积的部分放射性就会很强，在这种情况下，应以相关部位对示踪剂的蓄积率来考虑示踪剂用量。在细胞培养，切片保温，酶反应等示踪实验中，应依据实验目的、反应时间及反应体积的不同来考虑示踪剂的用量，通常小于一个微居里或几个微居里。 由于放射性同位素存在辐射效应，应该根据使用的放射性核素的种类，将用量控制在最大允许剂量之内(maximun permissible dose)，以免因剂量过大所造成的辐射效应，给实验带来较大的误差。 2.选择示踪剂给入途径 整体示踪实验时，应根据实验目的，选择易吸收、易操作的给入途径，一般给予的数量体积小，要求给予的剂量准确，防止可能的损失和不必要的污染。体外示踪实验时，应根据实验设计的实验步骤的某个环节加入一定剂量的示踪到反应系统中去，力求操作准确，仔细。 3.放射性生物样品的制备 根据实验目的和示踪剂的标记放射性同位素的性质制备放射性生物样品，其中放射性同位素的性质是生物样品制备形式的主要依据。若是释放r射线的示踪剂，则样品制备比较容易，只要定量地取出被测物放入井型NaI(TL)晶体内就能测定;若是释放出硬β射线的示踪剂，须将生物样品制成厚度较薄的液体，或将液体铺样后烘干，也可灰化后铺样，放入塑料晶体闪烁仪内测定，或用钟罩型盖一革计数管探测;若标记同位素仅释放软β射线，那么样品应制成液体闪烁样品(详见放射性测量”一章)，在液体闪烁计数器内测量。不论采用何种测量方法，都应该对样品作定量采集。对某些放射性分散的样品，应当作适当浓集，如测定组织内蛋白质的放射性，应对蛋白质作提取处理然后制备成相应的测量样品。有些样品需采用灰化法，但灰化法对易挥发的同位素或易挥发的组织样品不合适。 4.放射性样品的测量 测量方法分为绝对测量和相对测量。绝对测量是对样品的实有放射性强度作测量，求出样品中标记同位素的实际衰变率，在作绝对测量时，要纠正一些因素对测量结果的影响，这些因素包括仪器探头对于放射源的相对立体角、射线被探头接收后被计数的几率、反散射、 放射源的自吸收影响等等。而相对测量只是在某个固定的探测仪器上作放射性强度的相对测量，不追求它的实际衰变率。在一般的示踪实验中，大多采用相对测量的方法，比较样品间的差异。在相对测量时，要注意保持样品与探测器之间的几何位置固定。几何条件的影响是放射性测量中最重要的影响因素。当两个放射性强度相同的样品在测量中所置的几何位置不一，或样品制备过程造成的几何条件差异，其计数会相差很多，尤其当样品与探头之间距离较近时，两者计数率相差会很大。但是当样品与探头之间相距较远时，由于样品与探头之间形成的相对立体角较小，所以两者计数率的差异会显著减小。在用纸片法测量3H标记物的放射性强度时，要注意纸片在闪烁瓶中的位置，一批样品应该一致，如果是将滤纸剪成圆状作支持物，圆片的直径最好与闪烁瓶底的直径相等，保证滤纸在闪烁瓶内的位置固定。减小几何条件对放射性测量的影响可以从三方面入手:⑴选择探测窗大的探测器，如光电倍增管作探头的探测器;⑵在样品制备时，注意尽量将样品做成点状源，这样当样品的放射性强度较弱时，由于距离探测窗较近而有可能造成的水平位移的影响就可以忽略;⑶无论样品距离探测窗远近，样品都应置于探测窗的垂直轴线上，以减少样品与探测窗之间的相对立体角。 (三)放射性去污染和放射性废物处理 放射性实验，无论是每次实验或阶段性实验结束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性废物的出现，因此，在实验结束后，要作去污染处理和放射性废物处理。必要时在实验过程进行中，就要作除污染和清理放射性废物的工作。 三、同位素示踪法在生物化学和分子生物学中的应用 放射性同位素示踪法在生物化学和分子生物学领域应用极为广泛，它为揭示体内和细胞内理化过程的秘密，阐明生命活动的物质基础起了极其重要的作用。近几年来，同位素示踪技术在原基础上又有许多新发展，如双标记和多标记技术，稳定性同位素示踪技术，活化分析，电子显微镜技术，同位素技术与其它新技术相结合等。由于这些技术的发展，使生物化学从静态进入动态，从细胞水平进入分子水平，阐明了一系列重大问题，如遗传密码、细胞膜受体、RNA-DNA逆转录等，使人类对生命基本现象的认识开辟了一条新的途径。下面仅就同位素示踪技术在生物化学和分子生物学中应用的几个主要方面作一介绍。 1.物质代放谢的研究 体内存在着很多种物质，究竟它们之间是如何转变的，如果在研究中应用适当的同位素标记物作示踪剂分析这些物质中同位素含量的变化，就可以知道它们之间相互转变的关系，还能分辩出谁是前身物，谁是产物 ，分析同位素示踪剂存在于物质分子的哪些原子上，可以进一步推断各种物质之间的转变机制。为了研究胆固醇的生物合成及其代谢，采用标记前身物的方法，揭示了胆固醇的生成途径和步骤，实验证明，凡是能在体内转变为乙酰辅酶A的化合物，都可以作为生成胆固醇的原料，从乙酸到胆固醇的全部生物合成过程，至少包括36步化学反应，在鲨烯与胆固醇之间，就有二十个中间物，胆固醇的生物合成途径可简化为:乙酸→甲基二羟戊酸→胆固醇 又如在研究肝脏胆固醇的来源时，用放射性同位素标记物3H-胆固醇作静脉注射的示踪实验说明，放射性大部分进入肝脏，再出现在粪中，且甲状腺素能加速这个过程，从而可说明肝脏是处理血浆胆固醇的主要器官，甲状腺能降低血中胆固醇含量的机理，在于它对血浆胆固醇向肝脏转移过程的加速作用。 2.物质转化的研究 物质在机体内相互转化的规律是生命活动中重要的本质内容，在过去的物质转化研究中，一般都采用用离体酶学方法，但是离体酶学方法的研究结果，不一定能代表整体情况，同位素示踪技术的应用，使有关物质转化的实验的周期大大缩短，而且在离体、整体、无细胞体系的情况下都可应用，操作简化，测定灵敏度提高，不仅能定性，还可作定量分析。 在阐明核糖苷酸向脱氧核糖核苷酸转化的研究中，采用双标记法，对产物作双标记测量或经化学分离后分别测量其放射性。如在鸟嘌呤核苷酸(GMP)的碱基和核糖上分别都标记上14C，在离体系统中使之参入脱氧鸟嘌呤核苷酸(dGMP)，然后将原标记物和产物(被双标记GMP掺入的dGMP)分别进行酸水解和层析分离后，测定它们各自的碱基和戊糖的放射性，结果发现它们的两部分的放射性比值基本相等，从而证明了产物dGMP的戊糖就原标记物GMP的戊糖，而没有别的来源，否则产物dGMP的碱基和核糖的比值一定与原标记物GMP的两部分比值有显著差别。这个实验说明戊糖脱氧是在碱基与戊糖不分记的情况下进行的，从而证明了脱氧核糖核苷酸是由核糖核苷酸直接转化而来的，并不是核糖核苷酸先分解成核糖与碱基，碱基再重新接上脱氧杭核糖。无细胞的示踪实验可以分析物质在细胞内的转化条件，例如以3H-dTTP为前身物作DNA掺入的示踪实验，按一定的实验设计掺入后，测定产物DNA的放射性，作为新合成的DNA的检出指标。 3.动态平衡的研究 阐明生物体内物质处于不断更新的动态平衡之中，是放射性同位素示踪法对生命科学的重大贡献之一，向体内引入适当的同位素标记物，在不同时间测定物质中同位素含量的变化，就能了解该物质在体内的变动情况，定量计算出体内物质的代谢率，计算出物质的更新速度和更新时间等等。机体内的各种物质都在有大小不同的代谢库，代谢库的大小可用同位素稀释法求也。 4.生物样品中微量物质的分析 在放射性同位素示踪技术被应用之前，由于制备样品时的丢失而造成回收率低以及测量灵敏度不高等问题，使得对机体正常功能起很重要作用的微量物质不易被测定。近年来迅速发展、应用愈来愈广泛的放射免疫分析(radioimmunoassay)技术是一种超微量的分析方法，它可测定的物质300多种，其中激素类居多，包括类固醇激素，多肽类激素，非肽类激素，蛋白质物质，环核苷酸，酶，肿瘤相关的抗原，抗体以及病原体，微量药物等其它物质。 5.最近邻序列分析法(Nearest neighbour-sequence analysis method) 放射性同位素示踪技术，是分子生物学研究中的重要手段之一，对蛋白质生物合成的研究，从DNA复制、RNA转录到蛋白质翻译均起了很大的作用。最近邻序列分析法应用同位素示踪技术结合酶切理论和统计学理论，研究证实了DNA分子中碱基排列规律，在体外作合成DNA的实验:分四批进行，每批用一种不同的32P标记脱氧核苷三磷酸，32P标记在戊糖5'C的位置上，在完全条件下合成后，用特定的酶打开5'C-P键，使原碱基上通过戊糖5'C相连的32P移到最邻近的另一单核苷酸的3'C上 。用最近邻序列分析法首次提出了DNA复制与RNA转录的分子生物学基础，从而建立了分子杂交技术，例如以噬体T2-DNA为模板制成[32P]RNA，取一定量T2-DNA和其它一些DNA加入此[32P]RNA中，经加热使DNA双链打开，并温育，用密度梯度离心或微孔膜分离出DNA-[32P]RNA复合体测其放射性，实验结果只有菌体T2的DNA能与该[32P]RNA形成放射性复合体。从而证明了RNA与DNA模板的碱基呈特殊配对的互补关系，用分子杂交技术还证实了从RNA到DNA的逆转录现象。此外，放射性同位素示踪技术对分子生物学的贡献还表现在:⑴对蛋白质合成过程中三个连续阶段，即肽链的起始、延伸和终止的研究;⑵核酸的分离和纯化;⑶核酸末端核苷酸分析，序列测定;⑷核酸结构与功能的关系;⑸RNA中的遗传信息如何通过核苷酸的排列顺序向蛋质中氨基酸传递的研究等等。为了更好地应用放射性同位素示踪技术，除了有赖于示踪剂的高质量和核探测器的高灵敏度外，关键还在于有科学根据的设想和创造性的实验设计以及各种新技术的综合应用。