生物法制备薯蓣皂素的清洁生产工艺

【摘要】：薯蓣皂素是生产甾体激素类药物的重要原料,具有多种生物活性。黄姜是世界上含有薯蓣皂苷最多的物种。黄姜中的薯蓣皂苷脱糖后即得到薯蓣皂素。黄姜生产薯蓣皂素的传统工艺使用浓硫酸或盐酸,酸的大量使用对环境污染严重,并且导致资源利用不充分。本文旨在研发一种清洁制备薯蓣皂素的生产工艺,并同时实现黄姜资源的利用。首先初探微生物法,酶法以及复合法制备薯蓣皂素的不同工艺,成功筛选到一条复配酶法清洁生产工艺。然后对此工艺进行优化,对其机理进行探究,为实现清洁生产工艺的工业化做铺垫。本文主要研究内容及结果如下：1.以薯蓣皂素得率为依据,对2种微生物(米曲霉／黑曲霉)多种发酵工艺；9种商品酶的11种复配组合工艺；以及商品酶微生物发酵复合工艺的结果进行对比研究,筛选到一条复配酶法制备薯蓣皂素的清洁工艺。2.对筛选到的复配酶法生产工艺条件进行逐一优化,得到最佳的反应条件为pH值5.0,温度50℃,纤维素酶反应48h后,加入p-葡萄糖苷酶反应36h,此工艺薯蓣皂素产量为31.68mg/g,并联产葡萄糖230mg/g。为更大程度的提高薯蓣皂素产量,在原始工艺上复合酸解法,成功的将薯蓣皂素产量提高到传统酸解方法的128%,并且降低70%酸用量,实现一锅法反应。3.通过研究复配酶法生产工艺中6种薯蓣皂苷的分布、酶解的转化通路以及酶解前后的黄姜材料的TGA、FTIR表征,对复配酶转化法的机理进行探讨。在整个复配酶法过程中,纤维素酶起到了降解淀粉及转化三种仅含有葡萄糖皂苷的作用。p-葡萄糖苷酶可以作用于6种薯蓣皂苷,将其降解为薯蓣皂素。薯蓣皂苷的分布研究表示,天然薯蓣皂苷中存在着53%的疏水皂苷以及47%的亲水皂昔,而再经过了复配酶酶解之后,水相中无法检测到薯蓣皂苷。复配酶的作用使得薯蓣皂苷的糖链不断缩短,推测其作用使得更多的亲水性薯蓣皂苷转化为疏水性薯蓣皂苷,因此固渣含有更多游离薯蓣皂苷。复合酸解进一步将固渣中未转化的薯蓣皂苷转化为薯蓣皂素,更进一步提高了薯蓣皂素的产量。目前,微生物转化法生产工艺,基因重组酶转化薯蓣皂苷的实验探索较多,但鲜有商品化酶转化薯蓣皂素的实际生产工艺研究。本文首次完全利用商品化酶将黄姜转化为薯蓣皂素,并实现了传统方法90%得率。同时提出一锅法概念,工艺简单,为酶法制备薯蓣皂素清洁生产工艺的工业化实现提供理论支持和依据。 【关键词】：薯蓣皂素 黄姜 生物转化 复配酶解 薯蓣皂苷
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ464.3;TQ920.6
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-18
• 第一章 绪论18-26
• 1.1 甾体皂苷18
• 1.2 薯蓣皂素18-19
• 1.3 黄姜19-20
• 1.4 黄姜转化薯蓣皂素的生产工艺20-23
• 1.4.1 传统生产工艺20
• 1.4.2 生物法制备薯蓣皂素生产工艺20-23
• 1.4.2.1 微生物转化法及复合物法制备薯蓣皂素生产工艺21-22
• 1.4.2.2 酶转化法制备薯蓣皂素生产工艺22-23
• 1.5 本文的立项依据及研究思路23-26
• 1.5.1 研究目的及意义23
• 1.5.2 研究内容23-26
• 第二章 生物法制备薯蓣皂素的初步探究26-45
• 2.1 实验仪器与实验材料26-27
• 2.1.1 实验材料26
• 2.1.2 实验仪器26-27
• 2.1.3 实验菌种27
• 2.2 微生物转化法制备薯蓣皂素27-31
• 2.2.1 薯蓣皂素和葡萄糖标准曲线27-28
• 2.2.1.1 薯蓣皂素标准曲线27
• 2.2.1.2 葡萄糖标准曲线27-28
• 2.2.2 米曲霉固态发酵黄姜转化皂苷28-30
• 2.2.2.1 斜面培养基的制备28
• 2.2.2.2 种子培养基的制备28
• 2.2.2.3 固态发酵培养基的配制28-29
• 2.2.2.4 接种和发酵培养29
• 2.2.2.5 菌体破碎29
• 2.2.2.6 发酵粗酶液的提取29
• 2.2.2.7 发酵粗酶酶解反应29-30
• 2.2.2.8 薯蓣皂素的提取及检测30
• 2.2.3 黑曲霉发酵30-31
• 2.2.3.1 发酵培养基的配制30
• 2.2.3.2 接种和发酵培养30-31
• 2.2.3.3 发酵粗酶液的提取31
• 2.2.3.4 发酵粗酶酶解反应31
• 2.2.3.5 薯蓣皂素的提取及检测31
• 2.3 酶转化法制备薯蓣皂素31-35
• 2.3.1 缓冲液的配制32-33
• 2.3.2 淀粉酶33
• 2.3.3 糖化酶33
• 2.3.4 果胶酶33-34
• 2.3.5 木聚糖苷酶34
• 2.3.6 纤维素酶34
• 2.3.7 β-葡萄糖苷酶酶34-35
• 2.3.8 柚苷酶35
• 2.3.9 复配酶工艺35
• 2.4 复合转化法制备薯蓣皂素实验内容35-36
• 2.4.1 商品化酶酶解过程36
• 2.4.2 发酵粗酶液酶解过程36
• 2.4.3 薯蓣皂素的提取及检测36
• 2.5 微生物转化及复合法制备薯蓣皂素工艺探究36-42
• 2.5.1 薯蓣皂素标准曲线的绘制36-37
• 2.5.2 葡萄糖标准曲线的绘制37-38
• 2.5.3 米曲霉固态发酵转化黄姜38-40
• 2.5.4 黑曲霉发酵黄姜转化皂苷40-42
• 2.6 酶转化法制备薯蓣皂素结果探究42-43
• 2.7 生物法制备薯蓣皂素小结43-45
• 第三章 复配酶法制备薯蓣皂素的清洁生产工艺45-66
• 3.1 实验仪器和材料45
• 3.1.1 实验所用试剂和材料45
• 3.1.2 实验所用仪器45
• 3.2 实验内容45-49
• 3.2.1 标准酸解法实验工艺45-46
• 3.2.2 复配酶法工艺反应工艺的优化46
• 3.2.3 复配酶法工艺反应中温度、pH、反应时间的优化46-47
• 3.2.4 复配酶工艺固液比、酶用量的优化47
• 3.2.5 复配酶法复合酸解法工艺47
• 3.2.6 复配酶法工艺产物的结构鉴定47
• 3.2.7 复配酶法工艺的结构表征47-48
• 3.2.8 复配酶法工艺中皂苷的分布48
• 3.2.9 复配酶法工艺中转化通路的研究48
• 3.2.10 复配酶法制备薯蓣皂素工艺放大48
• 3.2.11 复配酶法降低成本解决方案的实验探究48-49
• 3.3 复配酶制备薯蓣皂素结果探究49-66
• 3.3.1 标准酸解法49-50
• 3.3.2 复配酶法工艺条件中糊化及复配酶反应时间对实验结果的影响50-52
• 3.3.3 复配酶法工艺反应中温度、pH对实验结果的影响52
• 3.3.4 复配酶法工艺固液比、酶用量对实验结果的影响52-54
• 3.3.5 复配酶法复合酸法工艺54
• 3.3.6 复配酶法工艺产物结构鉴定54-56
• 3.3.7 复配酶法工艺处理结构表征-TGA56-57
• 3.3.8 复配酶法工艺处理结构表征-FTIR57
• 3.3.9 复配酶法工艺中皂苷的转化通路57-59
• 3.3.10 复配酶法处理后对皂苷分布的研究59-61
• 3.3.11 复配酶法制备薯蓣皂素工艺放大研究61
• 3.3.12 复配酶法降低成本的解决方案探究61-64
• 3.3.13 小结64-66
• 第四章 结论66-68
• 参考文献68-72
• 附录一 实验材料及试剂72-74
• 附录二 实验仪器74-76
• 致谢76-78
• 作者和导师简介78-79
• 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书79-80

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