细菌与甲烷菌在牦牛瘤胃中的时间动态及其在消化道的空间分布

【摘要】：青藏高原被称为世界“第三极”,拥有全球海拔最高、面积最大和唯一被四季放牧利用的高寒草地。独特的高寒生态环境(高海拔、寒冷、缺氧、紫外线强、牧草季节供应严重失衡),使得生存于此的牦牛种群在协同进化过程中产生了一系列特殊的适应机制。近年来的研究发现,与黄牛相比,牦牛在消化器官组织结构、牧食行为、氮素利用效率、甲烷排放、瘤胃甲烷菌菌群结构、季节间能量分配等方面均优于黄牛;并从牦牛全基因组测序中找到了适应高寒营养胁迫的相关功能基因。为此我们推断,长期的极端环境与营养胁迫,使细菌/甲烷菌在牦牛瘤胃和不同肠道部位中分别形成了特殊的时间动态和空间分布模式,以帮助宿主提高能量利用效率和有效应对每年长达8个月的冷季营养匮乏。本试验以牦牛为研究对象,主要利用通用引物515F/806R通过16S二代高通量测序,分析了细菌/甲烷菌在瘤胃中的定植过程(3、14、60、180、365和730天)、季节动态(春、夏、冬)和不同肠道部位(19个部位)的空间分布,拟寻找牦牛肠道微生态系统中有助于宿主适应高寒严酷生态系统的特殊微生物群落,为进一步通过调控肠道微生态系统提高牦牛生产性能和实现藏区畜牧业的可持续发展提供理论基础和技术支撑。本研究得到的主要结果如下:1.牦牛瘤胃细菌/甲烷菌定植过程中丰度指数Chao1的增加分为三个梯度,3和14天为第一阶段,60、180和365天为第二阶段,730天为第三阶段;多样性指数Shannon在3、14天低于其它年龄组(P0.05),其它年龄组之间没有差异(P0.05)。2.牦牛瘤胃细菌定植过程中优势门水平的细菌是厚壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)三大类,约占85%。其中厚壁菌门(Firmicutes)所占的比例最高,在不同年龄组之间维持在约50%;拟杆菌门(Bacteroidetes)从3天的23%增加到了730天的43%;变形菌门(Proteobacteria)从3天的17%降低到了730天的2.3%。以上两种菌门的增加/降低都呈现出幼龄段(3、14天)、发育段(60、180天)和成年段(365、730天)阶梯式的变化。3.牦牛瘤胃甲烷菌—广古菌门从3天的0.3%增加到60天最高的2%,随后在成年组(365、730天)维持在约1.3%。4.瘤胃微生物定植过程中的途径主要是通过母畜唾液,将从母畜瘤胃中反刍带到口腔的瘤胃微生物转移到幼龄反刍动物的瘤胃中。5.牦牛瘤胃细菌/甲烷菌季节变化过程中的丰度指数Chao1从大到小的顺序是春夏秋,多样性指数Shannon与丰度指数呈现相同的趋势,但是春夏两季之间多样性更加接近。同一季节组内相似性春季最低,夏季最高。6.不同季节间以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌,在春、夏、冬三个季节所占的比例分别为75%、80%和77%。其中拟杆菌门的组成比例在春季最低约45%,在夏冬两季基本相同约为54%;而厚壁菌门在春夏冬三个季节的比例分别是30、26、23%。7.在冷季(春冬两季),由于牦牛采食牧草中的纤维含量增高,瘤胃微生物中分解纤维的菌属高于暖季(夏季),而夏季中降解植物次级代谢产物和利用可溶性糖、氨基酸的菌属高于冷季。春季中的纤维降解菌属的种类和比例高于冬季。牦牛瘤胃甲烷菌的比例在冬季最低,而春夏两季的比例基本相同。8.在相同的低氮日粮下,牦牛和黄牛不同肠道部位的细菌/古菌Alpha和Beta多样性没有差异。细菌/甲烷菌在不同肠道部位的丰度指数(Chao1)和多样性指数(Shannon),都是在前肠道内容物和大肠最高,前肠道壁次之,小肠中最低。不同肠道部位同一样品组内微生物多样性在小肠部位最低,其次是大肠,前肠道(内容物和肠道壁)中相似性最高。9.忽略不同的肠道部位,在门水平的优势细菌是厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes),在前肠道和小肠约占75%,而大肠中的占比高达90%。厚壁菌门(Firmicutes)在小肠和大肠中的比例高于前肠道,而拟杆菌门(Bacteroidetes)在前肠道部位高于小肠和大肠。甲烷菌的比例在小肠高于肠道其它部位。Cyanobacteria菌门在牦牛不同肠道部位的比例高于黄牛。10.在前肠道壁分布的优势菌属主要参与氧气、尿素和挥发性脂肪酸的吸收利用;前肠道部位内容物中比例较高的菌属主要负责来自日粮中的纤维素、植物次级代谢产物、淀粉和糖类的降解与利用;小肠中具有优势的菌属很少,主要是参与维生素的合成和黏素的降解;大肠主要负责吸收和利用一些没有被前肠道部位消化吸收的糖类、次级代谢产物和盐类。PICRUSt功能分析显示牦牛肠道微生态中比黄牛存在更多未知的菌群。与KEGG数据库比对,牦牛高于黄牛的基因家族的数量要多于黄牛高于牦牛的数量,其中能量储存、脂质代谢和聚糖合成和代谢的三大基因家族在牦牛要高于黄牛,这些基因家族的差异,可能会帮助牦牛提高能量利用效率。本试验首次全面分析了细菌/甲烷菌在放牧牦牛瘤胃中的时间动态和不同肠道部位的空间分布。同时,利用PICRUSt对细菌/甲烷菌的基因功能进行了全面预测,为青藏高原极端环境条件下的牦牛肠道微生物如何应对严酷的环境胁迫提供了重要的科学依据和理论支撑。 【关键词】：牦牛 细菌 甲烷菌 瘤胃 定植 季节 肠道部位
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823.85
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-13
• 第一章 绪论13-31
• 1.1 研究背景13-14
• 1.1.1 青藏高原的特点及面临的威胁13
• 1.1.2 青藏高原畜牧业现状13
• 1.1.3 反刍动物甲烷排放及减排措施13-14
• 1.2 文献综述14-27
• 1.2.1 肠道微生态研究进展14-15
• 1.2.2 甲烷菌研究进展15-19
• 1.2.3 反刍动物肠道细菌的功能19-21
• 1.2.4 不同年龄瘤胃细菌/甲烷菌的定植过程21-24
• 1.2.5 瘤胃细菌/甲烷菌对于季节响应模式的研究现状24-25
• 1.2.6 不同肠道部位细菌的分布25-27
• 1.3 本研究的意义与目的27-28
• 1.4 研究内容28-30
• 1.4.1 不同年龄牦牛瘤胃细菌/甲烷菌的定植过程28
• 1.4.2 牦牛瘤胃细菌/甲烷菌的季节动态28
• 1.4.3 相同日粮下不同肠道部位牦牛和黄牛细菌/甲烷菌的空间分布28-30
• 1.5 技术路线30-31
• 第二章 不同年龄牦牛瘤胃细菌/甲烷菌的定植过程31-70
• 2.1 前言31
• 2.2 材料和方法31-46
• 2.2.1 试验地点31-32
• 2.2.3 试验动物及管理方式32
• 2.2.4 基因组DNA的提取32-34
• 2.2.5 基因组DNA的测序分析34-36
• 2.2.6 测序结果分析36-38
• 2.2.7 功能基因预测38-39
• 2.2.8 实时定量PCR分析功能菌的绝对数量39-46
• 2.3 结果46-60
• 2.3.1 瘤胃细菌/古菌Alpha多样性46-47
• 2.3.2 不同年龄瘤胃细菌/古菌Beta多样性分析47-48
• 2.3.3 门水平的细菌/甲烷菌组成48-49
• 2.3.4 属水平的细菌/甲烷菌组成49-54
• 2.3.5 基于 16S的功能预测54-58
• 2.3.6 代表性功能菌的实时定量分析58
• 2.3.7 瘤胃微生物定植来源58-60
• 2.4 讨论60-69
• 2.4.1 不同年龄牦牛瘤胃细菌/甲烷菌的多样性60-62
• 2.4.2 不同年龄牦牛瘤胃细菌/甲烷菌门水平的变化62-64
• 2.4.3 不同年龄牦牛瘤胃细菌/甲烷菌属水平的变化64-66
• 2.4.4 细菌/甲烷菌功能基因家族预测66-67
• 2.4.5 代表性功能菌的定量分析67-68
• 2.4.6 瘤胃微生物定植来源68-69
• 2.5 小结69-70
• 第三章 牦牛瘤胃细菌/甲烷菌的季节动态70-87
• 3.1 前言70-71
• 3.2 材料和方法71-72
• 3.2.1 试验地点71
• 3.2.2 试验动物71
• 3.2.3 基因组DNA的提取71
• 3.2.4 基因组DNA的测序分析71-72
• 3.2.5 测序结果分析72
• 3.2.6 实时定量PCR分析功能菌的绝对数量72
• 3.3 结果72-82
• 3.3.1 不同季节瘤胃细菌/甲烷菌的多样性72-74
• 3.3.2 不同季节瘤胃细菌/甲烷菌门水平的变化74-75
• 3.3.3 不同季节瘤胃细菌/甲烷菌属水平的变化75-79
• 3.3.4 不同季节细菌/甲烷菌功能预测79-81
• 3.3.5 不同季节代表性功能菌的实时定量分析81-82
• 3.4 讨论82-86
• 3.4.1 不同季节瘤胃细菌/甲烷菌多样性82-84
• 3.4.2 不同季节瘤胃细菌/甲烷菌门水平的变化84
• 3.4.3 不同季节瘤胃细菌/甲烷菌属水平的变化84-85
• 3.4.4 不同季节细菌/甲烷菌功能预测85-86
• 3.4.5 不同季节代表性功能菌的实时定量分析86
• 3.5 小结86-87
• 第四章 相同日粮下不同肠道部位牦牛和黄牛细菌/甲烷菌的空间分布87-108
• 4.1 前言87-88
• 4.2 材料和方法88-92
• 4.2.1 试验地点88
• 4.2.2 试验动物与管理88-89
• 4.2.3 日粮配比89
• 4.2.4 样品采集89-91
• 4.2.5 基因组DNA的测序分析91
• 4.2.6 测序结果分析91
• 4.2.7 实时定量PCR分析功能菌的数量91-92
• 4.3 结果92-101
• 4.3.1 相同低氮日粮下牦牛细菌/甲烷菌多样性随着不同肠道部位的变化92-93
• 4.3.2 相同低氮日粮下牦牛不同肠道部位细菌/甲烷菌Beta多样性分析93
• 4.3.3 相同低氮日粮下牦牛门水平不同肠道部位细菌/甲烷菌的组成93-94
• 4.3.4 相同低氮日粮下牦牛不同肠道部位属水平的细菌/甲烷菌变化94-95
• 4.3.5 不同肠道部位细菌/甲烷菌功能预测95-96
• 4.3.6 相同低氮日粮下牦牛代表性功能菌在肠道不同部位的数量变化96-101
• 4.4 讨论101-106
• 4.4.1 不同肠道部位细菌/甲烷菌的多样性101-102
• 4.4.2 不同肠道部位细菌/甲烷菌门水平的变化102-103
• 4.4.3 不同肠道部位细菌/甲烷菌属水平的变化103-105
• 4.4.4 不同肠道部位细菌/甲烷菌功能预测105-106
• 4.4.5 不同肠道部位功能菌的实时定量分析106
• 4.5 小结106-108
• 第五章 结论与展望108-111
• 5.1 结论108-110
• 5.2 展望110-111
• 创新点111-112
• 参考文献112-121
• 个人简历及在学期间科研成果121-123
• 致谢123-124
• 附录124-131

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