柳枝稷发酵产甲烷过程中纤维素降解机制及微生物多样性变化

【摘要】：研究纤维素高效降解和甲烷高效生成的微生物群落结构是解决木质纤维素利用率低和产气量低的关键问题。本试验以结实期和拔节期的柳枝稷为粗饲料分别进行饲喂试验,收集驯化后的瘤胃液开展体外发酵试验,分析两种瘤胃发酵液在木质纤维素降解及甲烷生产方面的差别,并与传统沼液发酵过程生产性能进行对比,进一步通过高通量测序技术分析三种发酵液中微生物种群结构与多样性的差别,为揭示高效降解木质纤维素,提高甲烷产量的微生物群落结构的研究提供理论依据。 试验一、瘤胃液与沼液厌氧发酵效果的对比研究。分别以高、低木质纤维素柳枝稷驯化瘤胃液和沼液为发酵接种物,柳枝稷为发酵底物,在37℃条件下发酵72h；测定发酵过程中的产气量、气体成分、挥发性脂肪酸、pH值、铵态氮、可溶性糖以及底物NDF和ADF值。结果表明：累积产气量为低木质纤维素驯化瘤胃液(265ml)高木质纤维素驯化瘤胃液(157ml)沼液(120ml)。最高甲烷含量为沼液(33.76%)低木质纤维素驯化瘤胃液(27.36%)高木质纤维素驯化瘤胃液(24.05%)。最大固体分解量为低本质纤维素驯化瘤胃液(29.00%)高木质纤维素驯化瘤胃液(28.71%)沼液(21.39%),瘤胃液固体分解量显著高于沼液(P0.05)。另外,三种发酵液均表现为半纤维素分解率高于纤维素分解率,瘤胃液的纤维素和半纤维素最大分解率都显著高于沼液(P0.05)；纤维素分解率为低木质纤维素驯化瘤胃液(36.89%)高木质纤维素驯化瘤胃液(32.32%)沼液(13.47%)；半纤维素分解率为低木质纤维素驯化瘤胃液(34.86%)高木质纤维素驯化瘤胃液(33.60%)沼液(26.39%)。三种发酵液中VFA均呈现乙酸丙酸丁酸,且瘤胃液乙酸最大浓度显著高于沼液(P0.05),结果表明瘤胃液中乙酸很少被利用,出现酸累积现象,导致发酵后期的pH迅速降低至5.5左右,氨态氮浓度升高到2.3g/l,反应体系受到抑制,发酵过程停止。沼液中的VFA能够被很好的利用产生甲烷,使得pH稳定在6.6左右,氨态氮浓度稳定在1.8g/l。两种驯化瘤胃液和沼液中的纤维素酶,半纤维素酶和果胶酶活性均为沼液低木质纤维素驯化瘤胃液高木质纤维素驯化瘤胃液。 试验二、瘤胃液与沼液微生物多样性的对比研究。分别收集两种驯化瘤胃液和沼液样品,利用高通量技术进行基因组DNA序列分析,探讨瘤胃液和沼液中细菌、真菌和古菌的多样性。结果表明：瘤胃液的细菌主要分布在瘤胃球菌科(Ruminococcaceae),理研菌科(Rikenellaceae)，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae),毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和BSll_gut_group,而沼液中细菌群落含量大于8%的科仅有瘤胃球菌科和理研菌科。两种驯化瘤胃液的细菌群落的相似性很高,但瘤胃液与沼液细菌群落的相似性极低,三者的细菌群落物种丰富度都较高。高、低小质纤维素驯化瘤胃液和沼液真菌都主要分布在Neocallimastigaceae,比例分别为48.36%、78.06%和67.15%,两种驯化瘤胃液的真菌群落物种多样性存在较大差别,瘤胃液和沼液间的真菌群落结构的相似性高于细菌和占菌。两种驯化瘤胃液古菌物种间多样性基本没有差异,都含有很多未知古菌门和广古菌门的古菌类,含量分别占到总古菌门的90.96%和86.99%。沼液古菌数量高于：瘤胃液,集中分布在以下几个科Miscellaneous_Crenarchaeotic_Group_norank,甲烷粒菌科(Methanocorpusculaceae), Deep_Sea_Euryarchaeotic_Group,甲烷丝状菌科(Methanosaetaceae)和Deep_Sea_Hydrothermal_Vent_Gp_6,以上菌群未在瘤胃液中发现；瘤胃液与沼液古菌群落多样性差别很大,这可能是导致沼液中甲烷含量高于瘤胃液的原因。 综上所述,两种驯化瘤胃液的细菌、真菌和古菌的物种多样性均高于沼液。瘤胃液球菌科,理研菌科,普雷沃氏菌科和毛螺旋菌科细菌的增多可能有利于纤维素降解；瘤胃液球菌科和Neocallimastigaceae微生物种类和数量增加对纤维素降解起主要作用；Miscellaneous_Crenarchaeotic_Group_norank,甲烷粒菌科和甲烷丝状菌科的古菌种类及数量的增多有利于甲烷的生成。低木质纤维素柳枝稷驯化瘤胃液微生物群落对木质纤维素的利用率最高,沼液微生物群落产甲烷的能力最强。 【关键词】：瘤胃液 沼液 木质纤维素 甲烷 微生物多样性
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S816
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 缩略词表11-12
• 第一章 绪论12-27
• 1.1 研究背景与意义12-13
• 1.2 沼气的研究与发展现状13-14
• 1.2.1 甲烷、沼气与生物天然气内涵13
• 1.2.2 沼气的地位及发展现状13-14
• 1.3 草类能源植物研究与发展现状14-17
• 1.3.1 概念14
• 1.3.2 特征14
• 1.3.3 木质纤维素结构与降解14-15
• 1.3.4 能源植物柳枝稷的研究与发展现状15-17
• 1.4 降解纤维素和产甲烷的微生物研究进展17-20
• 1.4.1 细菌17-18
• 1.4.2 真菌18
• 1.4.3 甲烷菌18-19
• 1.4.4 瘤胃微生物应用于甲烷生产的研究19-20
• 1.5 瘤胃液体外厌氧发酵方法的研究20
• 1.6 木质纤维素产甲烷的发酵机理研究20-22
• 1.7 分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用22-25
• 1.7.1 宏基因组学概念23
• 1.7.2 高通量测序技术的发展23-24
• 1.7.3 Illumina MiSeq测序原理24
• 1.7.4 MiSeq技术在微生物多样性分析中的应用24-25
• 1.8 研究目的、研究内容和实施方案25-27
• 1.8.1 研究目的25
• 1.8.2 研究目标25
• 1.8.3 研究内容25-26
• 1.8.4 技术路线26-27
• 第二章 瘤胃液与沼液厌氧发酵效果的对比研究27-56
• 2.1 前言27
• 2.2 材料与方法27-34
• 2.2.1 试验材料27-28
• 2.2.2 试验设计与方法28-29
• 2.2.3 测定指标及分析方法29-33
• 2.2.4 统计分析33-34
• 2.3 结果与分析34-53
• 2.3.1 三种发酵液对产气率和累积产气量的影响34-35
• 2.3.2 三种发酵液对气体成分的影响35-37
• 2.3.3 三种发酵液对固体分解量和分解率的影响37-39
• 2.3.4 三种发酵液对木质纤维素成分及灰分的影响39-42
• 2.3.5 三种发酵液对纤维素和半纤维素分解率的影响42-45
• 2.3.6 三种发酵液对挥发性脂肪酸的影响45-48
• 2.3.7 三种发酵液对总酸和pH的影响48-50
• 2.3.8 三种发酵液对可溶性糖和氨态氮的影响50-51
• 2.3.9 三种发酵液对酶活性的影响51-53
• 2.4 讨论53-55
• 2.5 小结55-56
• 第三章 瘤胃液与沼液微生物多样性的对比研究56-88
• 3.1 前言56
• 3.2 材料与方法56-60
• 3.2.1 两种驯化瘤胃液和沼液基因组DNA提取57-60
• 3.2.2 分析项目60
• 3.3 结果与分析60-86
• 3.3.1 细菌群落多样性的研究60-70
• 3.3.2 真菌群落多样性的研究70-78
• 3.3.3 古菌群落多样性的研究78-86
• 3.4 讨论86-87
• 3.5 小结87-88
• 第四章 结论与展望88-89
• 4.1 结论88
• 4.2 创新点88
• 4.3 有待于进一步研究的问题88-89
• 参考文献89-98
• 致谢98-99
• 个人简介99

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