牦牛瘤胃厌氧真菌与甲烷菌共培养物的多样性及其纤维降解特性研究

【摘要】：青藏高原牦牛终年以放牧方式生活在海拔3000米以上的极端生态环境,栖息在瘤胃中的大量微生物使牦牛瘤胃成为高效降解木质纤维素的天然发酵罐。其中,厌氧真菌是一种重要的木质纤维素降解微生物。有研究认为,与瘤胃真菌共生的一些甲烷菌能够提高厌氧真菌纤维素降解活性,并促进木质纤维素降解代谢转化生成乙酸和甲烷。目前有关瘤胃厌氧真菌和甲烷菌之间的自然共存关系研究报道很少,为开发利用瘤胃内高效降解木质纤维素的优质真菌资源,本文首次以甘肃省天祝放牧牦牛为研究对象,利用亨氏厌氧滚管培养技术,分离获得了大量瘤胃厌氧真菌及甲烷菌自然共培养物,分析探讨了厌氧真菌和甲烷菌之间的自然共存关系,并开展了这些共培养物对农作物秸秆的木质纤维素降解功效和消化代谢研究,主要研究结果如下:1.牦牛瘤胃共培养物的多样性:自天祝全放牧牦牛瘤胃食糜液中分离获得生长稳定的厌氧真菌及甲烷菌共培养物20个,通过形态学结合ITS1序列分析鉴定厌氧真菌的种属,通过PCR-DGGE技术和16Sr DNA序列分析与厌氧真菌共生的甲烷菌的多样性和种类。20个共培养物包括4种组合类型:8个Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter ruminantium,1个Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter millerae,8个Neocallimastix frontalis+Methanobrevibacter ruminantium,3个Piromyces+Methanobrevibacter ruminantium。2.高效共培养物的筛选:以小麦秸秆为生长底物,通过检测产气量、多糖水解酶活性、酯酶活性、干物质降解率、酚酸释放量、甲烷和乙酸产量,研究发现8个共培养Neocallimastix frontalis+Methanobrevibacter ruminantium和3个共培养Piromyces+Methanobrevibacter ruminantium比9个共培养Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter ruminantium生长更加稳定快速,表现出更强的秸秆纤维降解活性。自20个3属真菌与甲烷菌共培养中,筛选出降解秸秆的3个高效共培养物分别为:O.joyonii Yak7+M.ruminantium,N.frontalis Yak16+M.ruminantium和Piromyces Yak18+M.ruminantium。3.高效共培养和相应的真菌纯培养对秸秆的降解能力比较:在上述2研究的基础上,以小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆为底物,在7天培养期内,3个高效共培养物中N.frontalis Yak16+M.ruminantium表现出最强的降解秸秆木质纤维素功能,产生最高活性木聚糖酶、滤纸纤维素酶、阿魏酸酯酶、乙酰酯酶、香豆酸酯酶、最高干物质降解率、中性和酸性洗涤纤维降解率和最多的酚酸释放量。甲烷菌M.ruminantium在不同程度上提高了3株厌氧真菌纯培养降解秸秆的功能,尤其是真菌纯培养N.frontalis Yak16本身以3种秸秆为底物具有较高干物质降解率,而与甲烷菌M.ruminantium形成自然共培养后进一步显著提高了真菌纯培养N.frontalis Yak16的降解功能,使共培养物N.frontalis Yak16+M.ruminantium成为高效降解秸秆木质素纤维素的最佳优势组合,最高值分别达到:以麦秸为底物木聚糖酶12500 m U,以玉米秸为底物滤纸酶430.3 m U,阿魏酸酯酶11.0 m U,乙酰酯酶199.3 m U,香豆酸酯酶5.0 m U,中性洗涤纤维降解率61.7%,酸性洗涤纤维降解率55.7%,阿魏酸释放24.1 ug/m L和p-香豆酸释放50.3μg/m L,以稻秸为底物的干物质降解率71.9%。4.高效共培养物和相应的真菌纯培养降解秸秆所产代谢产物比较:在上述3研究的基础上,以小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆为底物,在7天培养期内,3个高效共培养物相对应的3个纯培养真菌产生乙酸、乳酸、乙醇和氢气产量依次是N.frontalis Yak16﹥Piromyces Yak18﹥O.joyonii Yak7,尤其是厌氧真菌纯培养N.frontalis Yak16产生大量乙醇和乳酸,乙醇产量远高于以前文献报道。3个高效共培养产生乙酸、乳酸和甲烷产量依次是:N.frontalis Yak16+M.ruminantium﹥Piromyces Yak18+M.ruminantium﹥O.joyonii Yak7+M.ruminantium,尤其是共培养N.frontalis Yak16+M.ruminantium产生大量乙酸和甲烷,归因于甲烷菌M.ruminantium改变了厌氧真菌的代谢途径。根据上述结果,无论是厌氧真菌纯培养N.frontalis Yak16,还是厌氧真菌及甲烷菌共培养N.frontalis Yak16+M.ruminantium都可能在提高木质纤维素生物降解中具有重要的开发应用价值。综上所述,本文系统揭示了天祝放牧牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌之间的自然共生关系,并通过秸秆纤维降解对比试验阐释了牦牛瘤胃厌氧真菌在纯培养或与甲烷菌共培养条件下对不同作物秸秆的降解能力差异和代谢转化特性,为今后牦牛瘤胃微生物资源的开发利用与提高木质纤维素降解功效提供了理论科学依据。 【关键词】：牦牛 瘤胃 厌氧真菌 甲烷菌 共培养
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.6
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要中英文缩略表9-14
• 第一章 绪论14-38
• 1.1 研究背景14-16
• 1.2 文献综述16-34
• 1.2.1 牦牛16-18
• 1.2.2 秸秆和木质纤维18-21
• 1.2.3 瘤胃厌氧真菌21-23
• 1.2.4 瘤胃厌氧真菌及其微生态学特性23-25
• 1.2.5 厌氧真菌对木质纤维素的降解和消化代谢25-31
• 1.2.6 厌氧真菌及甲烷菌共培养对木质纤维素的降解及消化代谢31-34
• 1.3 研究意义34-36
• 1.3.1 厌氧真菌及甲烷菌共培养物的多样性研究34-35
• 1.3.2 厌氧真菌及甲烷菌共培养物的秸秆消化代谢和降解功效35-36
• 1.4 研究内容与目的36-37
• 1.4.1 研究目的36
• 1.4.2 研究内容36-37
• 1.5 技术路线37-38
• 第二章 牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌共培养物的分离和鉴定38-56
• 2.1 引言38
• 2.2 材料与方法38-43
• 2.2.1 采样地点概况与牦牛瘤胃液采集38-39
• 2.2.2 厌氧真菌培养基39
• 2.2.3 厌氧真菌及甲烷菌共培养物的选育39-40
• 2.2.4 厌氧真菌形态学鉴定40
• 2.2.5 厌氧真菌分子生物学鉴定40-41
• 2.2.6 甲烷菌鉴定41-42
• 2.2.7 厌氧真菌和产甲烷菌进化关系分析42
• 2.2.8 厌氧真菌及甲烷菌共培养物的扫描电镜42-43
• 2.3 试验结果43-54
• 2.3.1 厌氧真菌及甲烷菌共培养物的分离纯化43
• 2.3.2 厌氧真菌及甲烷菌共培养物的鉴定43-49
• 2.3.3 厌氧真菌及甲烷菌共培养物电镜照49-51
• 2.3.4 厌氧真菌和甲烷菌进化关系分析51-54
• 2.4 讨论54-55
• 2.5 小结55-56
• 第三章 牦牛瘤胃高效降解秸秆真菌及甲烷菌共培养物的筛选56-72
• 3.1 引言56
• 3.2 材料与方法56-60
• 3.2.1 筛选方法及筛选培养基56-57
• 3.2.2 实验设计和取样57
• 3.2.3 真菌及甲烷菌共培养物降解秸秆产气量测定57
• 3.2.4 真菌及甲烷菌共培养物降解秸秆产甲烷气相测定57
• 3.2.5 真菌及甲烷菌共培养物降解秸秆酶活测定57-59
• 3.2.6 真菌及甲烷菌共培养物降解秸秆干物质降解率测定59
• 3.2.7 真菌及甲烷菌共培养物降解秸秆产挥发酸液相测定59
• 3.2.8 真菌及甲烷菌共培养物降解秸秆释放酚酸液相测定59-60
• 3.2.9 数据统计分析60
• 3.3 试验结果60-68
• 3.3.1 高效共培养物的筛选60-63
• 3.3.2 高效共培养物纤维降解特性63-68
• 3.4 讨论68-70
• 3.4.1 高效共培养物总产气量和甲烷产量68
• 3.4.2 高效共培养物酶活68-69
• 3.4.3 高效共培养物干物质降解率69-70
• 3.4.4 高效共培养物酚酸释放70
• 3.4.5 高效共培养物乙酸产量70
• 3.5 小结70-72
• 第四章 牦牛瘤胃真菌及甲烷菌共培养和厌氧真菌纯培养降解秸秆功效研究72-91
• 4.1 引言72
• 4.2 材料与方法72-77
• 4.2.1 实验设计和取样73
• 4.2.2 秸秆基本营养成分测定73-74
• 4.2.3 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆产气量测定74
• 4.2.4 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆酶活测定74
• 4.2.5 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆纤维降解率测定74-77
• 4.2.6 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆释放酚酸液相测定77
• 4.2.7 数据统计分析77
• 4.3 试验结果77-85
• 4.3.1 秸秆基本营养成分测定77-78
• 4.3.2 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆产气量78-79
• 4.3.3 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆酶活79-81
• 4.3.4 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆纤维降解率81-83
• 4.3.5 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆酚酸释放量83-85
• 4.4 讨论85-89
• 4.4.1 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养产气量85-86
• 4.4.2 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养干物质降解率86-87
• 4.4.3 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养中性洗涤纤维降解率87-88
• 4.4.4 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养酸性洗涤纤维降解率88
• 4.4.5 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养酶活88-89
• 4.4.6 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养酚酸释放量89
• 4.5 小结89-91
• 第五章 牦牛瘤胃真菌及甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆消化代谢研究91-111
• 5.1 引言91
• 5.2 材料与方法91-94
• 5.2.1 实验设计和取样91-92
• 5.2.2 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆气体组分气相测定92
• 5.2.3 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆产挥发酸液相测定92
• 5.2.4 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆产乙醇气相测定92
• 5.2.5 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆产乳酸液相测定92
• 5.2.6 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆产琥珀酸液相-质谱测定92-94
• 5.2.7 数据统计分析94
• 5.3 试验结果94-108
• 5.3.1 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆气体组分94-95
• 5.3.2 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆产挥发酸95
• 5.3.3 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆产乙醇95
• 5.3.4 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆产乳酸95-96
• 5.3.5 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆产琥珀酸96
• 5.3.6 真菌-甲烷菌高效共培养所产甲烷，乙酸及木聚糖酶96-108
• 5.4 讨论108-110
• 5.4.1 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养的气体组分108
• 5.4.2 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养所产挥发酸和乙醇108-109
• 5.4.3 真菌-甲烷菌共培养和真菌纯培养所产乳酸和琥珀酸109-110
• 5.5 小结110-111
• 第六章 主要研究结论及展望111-114
• 6.1 论文总结111-113
• 6.1.1 共培养物多样性主要结论111
• 6.1.2 高效降解秸秆共培养物筛选主要结论111-112
• 6.1.3 高效共培养物降解秸秆功效主要结论112
• 6.1.4 高效共培养物降解秸秆消化代谢主要结论112-113
• 6.2 展望113-114
• 创新点114-115
• 参考文献115-131
• 攻读博士期间的科研成果131-132
• 致谢132

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