丁酸梭菌的分离及其预发酵对产沼气的影响研究

【摘要】：沼气是一种可再生的清洁能源，在我国北方地区，由于冬季漫长寒冷，沼气的生产存在发酵过程中过度酸化和产气率低等问题。针对这一现象，本文运用传统微生物学、现代分子生态学和生物学技术手段，从新鲜沼液中分离纯化出一株产丁酸的梭菌芽孢杆菌（Clostridium），并将其扩大培养后转接至厌氧发酵体系使之成为优势菌群，通过丁酸梭菌预发酵处理，将水解发酵阶段的产物控制为以丁酸为主的混合物，进而达到提高体系产沼气速率和产沼气量的目的。 （1）通过亨盖特厌氧操作技术，将沼液中的微生物富集培养，特异性地分离、筛选出1株梭状芽孢杆菌，并进一步进行验证实验，包括碳源实验、吲哚反应、明胶液化和淀粉水解等生理生化实验以及16S rDNA序列分析鉴定其为丁酸梭状芽孢杆菌。 （2）通过单因素实验，研究了初始pH值、发酵时间、培养温度、接种量、碳源和氮源对丁酸梭菌扩大培养的影响。优化出最佳条件为：初始pH值为8.0，培养温度为37.0℃，接种量为5.0%。发酵培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，碳酸氢氨10g/L，葡萄糖10g/L，盐溶液40ml，半胱氨酸0.5g/L，刃天青0.5ml/L(0.1%)，配置过程中严格厌氧。 （3）建立并优化实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）方法，监测沼气发酵过程中丁酸梭菌的动态变化规律。以定量的10倍梯度稀释的标准品为模板进行扩增和标准曲线的建立。结果显示各浓度标准品的扩增曲线间呈现良好的梯度分布，标准曲线的Ct值和起始模板拷贝数在1.9×101~1.9×106。拷贝间具有良好的线性关系，线性回归方程函数表达式为Y=－3.56X+57.55（代表起始模板拷贝数的对数，Y代表Ct值），且Ct值与起始模板的拷贝数的相关性为0.997。通过动态监测分析，体系内丁酸梭菌数量动态变化规律与丁酸产量的变化趋势相吻合。 （4）以猪粪为发酵基质，用丁酸梭菌对猪粪进行预发酵，提高沼气发酵产酸阶段的丁酸含量，降低丙酸含量。采用Plackett-Burman（P-B）试验确定丁酸发酵过程中的显著因素，采用中心组合试验设计（CCD）优化丁酸预发酵条件。结果表明最佳的发酵条件为：含水率、培养时间和温度分别为62.04%、27.22h和37.13℃。在优化出的最佳的条件下，丁酸的实际发酵产量达到21.13g/kg，利用数学模型模拟得知最佳丁酸产量为21.55g/kg，说明利用响应曲面法优化猪粪的丁酸预发酵是有效的。 （5）以优化后的丁酸预发酵条件进行沼气发酵，其沼气产量比未经预发酵的对照相比，沼气产气量提高19.02%。 【关键词】：丁酸梭菌 预发酵 实时荧光定量PCR 响应曲面法 沼气发酵
【学位授予单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S216.4
【目录】：

• 摘要8-9
• ABSTRACT9-11
• 第1章 绪论11-18
• 1.1 研究背景11-15
• 1.1.1 沼气概述11-12
• 1.1.2 沼气发酵的基本原理12-13
• 1.1.3 影响沼气发酵类型的菌群作用13-15
• 1.2 国内外研究现状15-16
• 1.3 论文目的意义和研究内容16-18
• 1.3.1 论文的目的与意义16-17
• 1.3.2 主要研究内容与技术路线17-18
• 第2章 丁酸梭菌的分离筛选与鉴定18-28
• 2.1 材料与方法18-23
• 2.1.1 主要实验试剂18
• 2.1.2 主要实验仪器18-19
• 2.1.3 主要实验培养基成分19
• 2.1.4 菌种来源19-20
• 2.1.5 菌株的分离及纯化方法20
• 2.1.6 菌株的形态学鉴定实验方法20-21
• 2.1.7 菌株的生理生化鉴定实验方法21-22
• 2.1.8 菌株的分子生物学鉴定实验方法22-23
• 2.2 结果与讨论23-27
• 2.2.1 菌株的分离及筛选结果23
• 2.2.2 菌株形态学鉴定实验结果分析23-24
• 2.2.3 菌株生理生化鉴定实验结果分析24-25
• 2.2.4 菌株分子生物学鉴定实验结果分析25-27
• 2.3 本章小结27-28
• 第3章 丁酸梭菌 B1 生长特性研究28-37
• 3.1 材料与方法28-31
• 3.1.1 实验菌株来源28
• 3.1.2 主要实验试剂28
• 3.1.3 主要实验仪器28-29
• 3.1.4 菌体浓度的测定方法29
• 3.1.5 种子培养条件和培养基的优化29-31
• 3.1.6 菌株生长曲线测定方法31
• 3.1.7 菌种复壮与活化31
• 3.2 结果与讨论31-36
• 3.2.1 种子培养条件优化31-32
• 3.2.2 培养基优化32-35
• 3.2.3 菌株生长曲线、pH 代谢曲线测定结果与讨论35-36
• 3.2.4 复壮与活化结果36
• 3.3 本章小结36-37
• 第4章 实时荧光定量 PCR 方法的建立37-44
• 4.1 材料和方法37-40
• 4.1.1 实验菌株与材料来源37
• 4.1.2 主要实验试剂37
• 4.1.3 主要实验仪器37
• 4.1.4 待测样品 DNA 制备37-39
• 4.1.5 引物及特异性实验验证39
• 4.1.6 标准品制备39-40
• 4.2 结果与讨论40-43
• 4.2.1 引物特异性验证结果.40
• 4.2.2 Realtime Quantitative PCR 标准曲线的建立40-43
• 4.2.3 样品定量检测结果43
• 4.3 本章小结43-44
• 第5章 丁酸梭菌的预发酵条件研究44-56
• 5.1 材料和方法44-47
• 5.1.1 实验菌株与材料来源44
• 5.1.2 主要实验试剂44-45
• 5.1.3 主要实验仪器45
• 5.1.4 发酵原料的预处理45
• 5.1.5 挥发酸测定方法45
• 5.1.6 荧光定量 PCR 测定方法45
• 5.1.7 中心复合实验优化丁酸型预发酵条件45-47
• 5.2 结果与讨论47-54
• 5.2.0 挥发酸标准样品的标准曲线47-48
• 5.2.1 各因素对丁酸产量的影响48-49
• 5.2.2 响应面分析49-53
• 5.2.3 最佳发酵条件53
• 5.2.4 模型验证53
• 5.2.5 预发酵过程中丁酸梭菌的变化53-54
• 5.3 本章小结54-56
• 第6章 丁酸梭菌预发酵对产沼气的影响56-59
• 6.1 材料和方法56-57
• 6.1.1 实验菌株和原料56
• 6.1.2 主要实验试剂56
• 6.1.3 主要实验仪器56
• 6.1.4 沼气发酵56-57
• 6.1.5 挥发酸测定方法57
• 6.1.6 沼气气体成分分析57
• 6.2 结果与讨论57-58
• 6.2.1 丁酸预发酵对沼气产量的影响57
• 6.2.2 沼气气体成分分析结果57-58
• 6.3 本章小结58-59
• 展望59-60
• 结论60-61
• 参考文献61-64
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文64-66
• 致谢66

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