规模化秸秆沼气反应器中微生物群落结构分析

【摘要】：中国是世界上秸秆资源最丰富的国家之一。利用农作物秸秆进行厌氧发酵产沼气，是一条清洁高效的秸秆能源化利用途径，但在秸秆沼气发酵过程中存在着产气不稳定等问题。因此，明确沼气发酵中的微生物群落，可为摸清以农作物秸秆为原料的厌氧沼气发酵规律，优化厌氧发酵工艺，保证厌氧反应器稳定运行及提高沼气产气率提供理论依据。 本文采用现代分子生物学分析方法，通过基于PCR的T-RFLP和克隆文库构建相结合的研究方法，对秸秆沼气工程中细菌、甲烷古菌与厌氧纤维素降解菌的群落结构进行分析，结果表明： (1)供试秸秆沼气发酵体系中细菌种类十分丰富，主要属于七大类群，分别为Firmicutes（厚壁菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Tenericutes（无壁菌门）、Actinobacteria（放线菌）和Synergistetes。其中以变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为主，三者分别占库容40.48%、30.1%与21.45%。其中的的优势细菌共有5种，经与Genebank中数据比较，分别类似于Thermopolyspora flexuosa、Clostridium jejuense、Solirubrobactersoli、Pseudomonas pseudoalcaligenes和Clostridium innocuum； (2)供试秸秆沼气发酵体系中古菌主要属于Euryarchaeota（广古菌门），包括七个属，分别为Methanobacterium（甲烷杆菌属）、Methanosphaerula（甲烷微菌属）、Methanocorpusculum（甲烷粒菌属）、Methanosarcina（甲烷八叠球菌属）、Methanosaeta（甲烷鬃毛菌属）、Methanolinea（甲烷绳菌属）、Methanospirillum（甲烷螺菌）。以秸秆为主要原料的厌氧发酵过程中，甲烷鬃菌属为优势微生物，相对丰度为69.2%-71.9%，而在秸秆与畜禽粪便混合发酵过程中，甲烷八叠球菌为优势微生物，相对丰度为73.1%。 (3)供试秸秆沼气发酵体系中厌氧纤维素降解菌主要属于Firmicutes（厚壁菌门），包括Clostridium（梭菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、Ruminococcus（瘤胃球菌属）、Paenibacillus（类芽孢杆菌属）四个属。其中主要的优势种群为Clostridium cellulovorans、Bacillus licheniformis和Clostridium stercorarium，体系中三者的相对丰度分别为14.41%-70.06%、10.88%-14.23%和10.11%-19.87%。 【关键词】：秸秆 沼气发酵 微生物群落 T-RFLP 克隆文库
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：X712;X172
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 中国规模化秸秆沼气工程现状12-15
• 1.1.1 秸秆的分布特征及特性12
• 1.1.2 秸秆原料预处理方法12-13
• 1.1.3 秸秆沼气发酵工艺类型13-15
• 1.1.4 沼气利用方式15
• 1.2 沼气发酵厌氧生物降解过程15-17
• 1.2.1 厌氧消化过程15-16
• 1.2.2 不产甲烷菌和产甲烷菌的关系16
• 1.2.3 厌氧纤维素降解菌在秸秆沼气工程中的作用16-17
• 1.3 秸秆沼气工程中微生物群落研究方法17-19
• 1.3.1 分子生物学研究微生物的方法17-18
• 1.3.2 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术18-19
• 1.4 研究目的和意义19-20
• 第二章 我国规模化秸秆沼气工程调研与样品采集20-22
• 2.1 秸秆沼气工程调研方法与内容20
• 2.1.1 调研范围20
• 2.1.2 调研内容20
• 2.1.3 我国规模化秸秆沼气工程的总体状况20
• 2.2 样品采集20-22
• 第三章 秸秆沼气工程中细菌群落结构分析22-44
• 3.1 实验材料22-23
• 3.1.1 厌氧污泥样品来源22
• 3.1.2 分子生物学试剂及培养基22
• 3.1.3 主要实验仪器及实验耗材22-23
• 3.2 实验方法23-30
• 3.2.1 基因组 DNA 提取23-24
• 3.2.2 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）分析24-26
• 3.2.3 克隆文库构建26-30
• 3.3 试验结果与分析30-43
• 3.3.1 基因组 DNA 提取结果30
• 3.3.2 细菌 T-RFLP 结果分析30-33
• 3.3.3 克隆文库33-42
• 3.3.4 T-RFLP 与克隆文库结果结合分析42-43
• 3.4 小结43-44
• 第四章 秸秆沼气工程中古菌群落结构分析44-57
• 4.1 实验材料44
• 4.2 实验方法44-47
• 4.2.1 基因组 DNA 提取44
• 4.2.2 T-RFLP 方法44-45
• 4.2.3 克隆文库方法45-47
• 4.3 实验结果与分析47-56
• 4.3.1 细菌 T-RFLP 结果分析47-50
• 4.3.2 克隆文库50-55
• 4.3.3 T-RFLP 与克隆文库结果结合分析55-56
• 4.4 小结56-57
• 第五章 秸秆沼气工程中纤维素降解菌的多样性分析及菌株初步分离57-70
• 5.1 实验材料57
• 5.1.1 厌氧污泥样品来源57
• 5.1.2 分子生物学试剂及培养基57
• 5.1.3 主要实验仪器及实验耗材57
• 5.2 实验方法57-60
• 5.2.1 基因组 DNA 提取57
• 5.2.2 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）分析57-59
• 5.2.3 克隆文库构建59-60
• 5.2.4 厌氧纤维素菌初步分离60
• 5.3 实验结果与分析60-69
• 5.3.1 Cel48 基因 T-RFLP 结果分析60-62
• 5.3.2 克隆文库62-67
• 5.3.3 T-RFLP 与克隆文库结果结合分析67-68
• 5.3.4 厌氧纤维素菌初步分离68-69
• 5.4 小结69-70
• 第六章 结论及工作展望70-72
• 6.1 结论70
• 6.2 工作展望70-72
• 参考文献72-77
• 致谢77-78
• 作者简介78

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