污水处理过程中厌氧氨氧化工艺的微生物生态学研究

【摘要】：分子生物学技术在近年来发展非常迅速，尤其在生态环境中氮循环和氮污染防治等研究领域取得了重大发展。在氮污染防治中，特别在城市废水生物脱氮方面，对于污水中氨氮的去除一直倍受研究人员关注。在短程硝化-厌氧氨氧化联合脱氮工艺中，厌氧氨氧化细菌(AnAOB)对总氮的彻底去除起着至关重要的作用。在短程硝化阶段，部分NH4+被硝化为NO2-，而后NH4+和NO2-一同进入厌氧氨氧化阶段，NO2-为电子受体和NH4+反应，最后转化为N2，而厌氧氨氧化细菌可以利用反应中产生的能量进行自身的新陈代谢。本文通过运用PLFA(磷脂脂肪酸)图谱分析技术和16SrDNA序列同源性分析技术两种分子生物学方法来分析和鉴定厌氧氨氧化系统中厌氧颗粒污泥的微生物群落结构，从而为整个反应系统运行参数、运行状态和处理效果的调整提供理论依据。 本文通过对厌氧反应器中活性污泥的细菌总DNA样品进行16S rDNA通用引物扩增、片段克隆和序列同源性进行分析，结果显示，在厌氧氨氧化系统中微生物群落具有高度多样性，在对160个阳性克隆子进行酶切分型后，存在31个OTUs。测序结果显示，这些细菌分别属于变形菌门，拟杆菌门，硝化螺旋菌门，酸杆菌门，绿弯菌门，Candidate division OP10和浮霉菌门7个类群。在对活性污泥的细菌总DNA样品浮霉菌特有16S rDNA引物进行扩增、克隆和基因序列比对，结果显示，在所挑取的50个克隆子中有43个克隆子的序列属于浮霉菌门下的Candidatus Kuenenia属。该属为厌氧氨氧化细菌菌属的一种，说明厌氧氨氧化细菌在浮霉菌门细菌中占到了86%。研究结果发现，16S通用引物无法对厌氧氨氧化细菌DNA片段进行扩增，原因是在基因库中没有与厌氧氨氧化细菌相匹配的16S rDNA序列。 本文又对厌氧氨氧化系统中携带联氨氧化还原酶基因(Ana-hzo)片段的菌群进行分析。经过克隆、测序后结果显示，所测得的厌氧氨氧化细菌序列大多属于浮霉菌门下Candidatus Kuenenia属Kuenenia stuttgartiensis菌种。该研究结果与浮霉菌特有16S rDNA克隆研究结果一致。 最后，本文利用磷脂脂肪酸图谱分析方法对不同时期厌氧氨氧化系统中厌氧活性颗粒污泥中的微生物群落结构进行动态分析。结果显示，在提取的所有磷脂脂肪酸中，主要分为偶数、奇数链饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、支链脂肪酸、多不饱和脂肪酸和一些环丙烷脂肪酸。在不同时段内，厌氧氨氧化反应器中的厌氧活性颗粒污泥的微生物群落结构无明显差异。在厌氧氨氧化工艺中，微生物主要以细菌为优势类群，而且其中以厌氧细菌为优势菌群，厌氧菌的PLFA的含量的在不同时期变化影响着NO2-的和NH4+的去除效果，是反应器平稳运行的关键。 【关键词】：微生物群落 活性污泥 厌氧氨氧化 16S rDNA AnAOB 磷脂脂肪酸
【学位授予单位】：河北科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X172;X703
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-16
• 1.1 研究背景10-11
• 1.2 研究现状11-14
• 1.2.1 废水生物脱氮工艺简介12-13
• 1.2.2 环境分子生物学技术与方法13-14
• 1.3 本课题研究的目的与意义14-15
• 1.4 本课题研究的内容15-16
• 第2章 厌氧氨氧化工艺16-19
• 2.1 厌氧氨氧化工艺的发展16-17
• 2.2 厌氧氨氧化工艺的特点及其影响因素17
• 2.2.1 厌氧氨氧化工艺的机理和特点17
• 2.2.2 影响厌氧氨氧化工艺的因素17
• 2.3 厌氧氨氧化工艺图17-19
• 第3章 样品采集及预处理19-24
• 3.1 厌氧颗粒污泥的采集19
• 3.2 污泥预处理及总 DNA 提取19-24
• 3.2.1 实验仪器与试剂20-22
• 3.2.2 试验方法22-24
• 第4章 16S rDNA法研究厌氧颗粒污泥细菌群落多样性24-39
• 4.1 引言24-25
• 4.2 实验材料与方法25-30
• 4.3 细菌的 16S rDNA 的多样性分析30-31
• 4.3.1 厌氧氨氧化工艺下细菌全长 16S rDNA 多样性分析30-31
• 4.3.2 厌氧氨氧化工艺下细菌浮霉菌特有 16S rDNA 多样性分析31
• 4.3.3 两个 16S rDNA 克隆文库的关系31
• 4.4 细菌的 16S rDNA 的微生物群落多样性31-34
• 4.4.1 厌氧氨氧化工艺下细菌全长 16S rDNA 群落分析31-33
• 4.4.2 厌氧氨氧化工艺下细菌浮霉菌特有 16S rDNA 群落分析33-34
• 4.5 细菌 16S rDNA 亲缘关系34-37
• 4.6 本章小结37-39
• 第5章 污泥中厌氧氨氧化基因(Ana-hzo)的研究39-44
• 5.1 引言39-40
• 5.2 实验材料与方法40-41
• 5.2.1 基因组的目的基因片段扩增40
• 5.2.2 扩增产物的验证与回收40-41
• 5.2.3 扩增产物的载体连接41
• 5.2.4 连接产物的细胞转化41
• 5.2.5 阳性克隆的培养41
• 5.2.6 阳性克隆子的酶切分型41
• 5.2.7 克隆子的测序41
• 5.3 厌氧氨氧化细菌的克隆文库的多样性分析41
• 5.4 厌氧氨氧化细菌的微生物群落多样性41-42
• 5.5 厌氧氨氧化细菌的亲缘关系42-43
• 5.6 小结43-44
• 第6章 磷脂脂肪酸法(PLFA)分析微生物多样性44-52
• 6.1 引言44-45
• 6.2 材料与方法45-46
• 6.2.1 样品的采集45
• 6.2.2 实验试剂与方法45-46
• 6.3 实验结果及数据分析46-51
• 6.3.1 样品中磷脂脂肪酸 GC-MS 图谱46-47
• 6.3.2 磷脂脂肪酸的组成及含量47-48
• 6.3.3 微生物群落结构及特征分布48-49
• 6.3.4 特征脂肪酸的比值分布及意义49-51
• 6.4 小结51-52
• 结论52-54
• 参考文献54-59
• 攻读硕士学位期间所获得的成果59-60
• 致谢60

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