活性污泥在适应不同污水处理过程中微生物群落及功能的进化研究

【摘要】：本研究在摇瓶和连续运行反应器两种体系条件下，利用454高通量测序、定量PCR以及功能基因克隆和序列测定等技术分析研究了城市污水处理厂活性污泥在适应印染废水和造纸废水过程中微生物群落组成和功能的演化过程，取得如下创新性结果： (1)城市污水厂中的活性污泥在摇瓶条件下对印染废水和造纸废水的处理结果。在摇瓶条件下，将城市污水处理厂活性污泥分别接种到造纸和印染废水中，分别经过41天和85天的驯化培养，造纸废水在处理周期为12h，进水COD和色度为916-1140mg/L、80-128倍的条件下，出水COD、色度分别为96-295mg/L、16-32倍，COD、色度去除率分别为76.49%-91%、60%-80%；印染废水在处理周期为24h，进水COD、色度分别为2360-3510mg/L、128-200倍条件下，出水COD和色度分别为356-2680mg/L和32-160倍，COD和色度去除率分别为20.2%-91.1%、10-75%； (2)城市污水厂中的活性污泥在摇瓶条件下适应印染废水和造纸废水过程中微生物群落组成的进化过程。利用DAPI染色和实时荧光定量PCR（Q-PCR）分析了造纸废水、印染废水及城市污水处理体系中微生物丰度的变化，结果表明，三个系统中微生物总数达到3.4×10~(13)-8.9×10~(14)个/g干污泥，其中细菌数量为4.38×10~(13)-1.68×10~(15)个/g干污泥,真菌数量为3.8×10~7-4.6×10~9个/g干污泥，三个系统中真菌与细菌的比例都是随着反应体系的运行逐渐降低。454高通量测序结果表明在三种废水处理体系中的优势细菌主要分布在变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）等；城市污水活性污泥中优势细菌类群为变形菌门(37.4%)，其中α-亚纲比例达到61.32%；城市污水活性污泥适应不同的工业废水过程中，微生物组成发生了明显变化，适应印染废水后，优势菌群仍为变形菌门(69.6%)，其中α-亚纲比例达到92.9%；适应造纸废水之后，优势菌群为厚壁菌门（56.4%），其中芽孢杆菌纲比例高达98.5%。 (3)生物活性碳反应器连续运行条件下对造纸废水的深度处理研究。分别构建了7.1L的活性炭反应器、活性污泥负载活性炭反应器和混合酵母菌负载活性炭反应器进行造纸废水常规物化处理后的出水的深度处理系统。经过245天连续处理，结果表明，在水力停留时间为12-16h,进水COD和色度分别为363-454mg/L、120-160倍的条件下，纯活性炭反应器的出水COD为110-285mg/L,色度为16-64倍，COD去除率为26.2-72.6%、色度去除率为37.5-68.9%；活性污泥负载活性炭反应器出水COD为128-261mg/L,色度为16-40倍，COD去除率为47.3-73.6%、色度去除率为75-86.7%；酵母菌负载活性炭反应器出水COD为126-273mg/L,色度为16-64倍，COD、色度去除率分别为32.1-66.7%、73-86.7%。运行50天之后，生物活性碳反应器的处理效果明显高于纯活性炭，酵母菌负载活性炭反应器对造纸废水的处理效果最佳，系统稳定时的COD去除率在66%左右，活性污泥负载活性炭反应器在系统稳定时的COD去除率维持在52%，而纯活性炭反应器在系统稳定时的COD去除率仅维持在44%。 (4)生物活性炭反应器对造纸废水连续深度处理条件下功能微生物群落的进化研究。分别对三种反应器不同运行时期取样进行定量PCR分析微生物群落结构，结果表明：细菌数量为1.95×10~(10)-7.18×10~(14)个/g活性炭，真菌数量为5.56×10~4-7.34×10~9个/g活性炭，在所有反应器中的不同运行时期细菌始终占据优势地位，真菌次之；真菌与细菌的比例在酵母菌负载活性炭反应器中明显高于另外两种反应器，但其随着反应的运行逐渐降低。对PAH双加氧酶功能基因的定量检测结果表明：在三种反应器中，该基因在活性污泥负载活性炭反应器中含量最高，革兰氏阳性菌PAH双加氧酶基因丰度略高于革兰氏阴性菌；这些功能基因的丰度在种污泥中较高，其在活性污泥负载活性炭反应器中随着系统运行，含量逐渐下降，但至系统稳定至180天时，其丰度逐渐升高，甚至超过种泥。每个反应器样品中分别挑取50个克隆进行PAH双加氧酶基因的多样性分析，结果表明，各反应器中该基因的多样性差别不显著，革兰氏阳性PAH双加氧酶酶基因主要分布在分支杆菌属（Mycobacterium）、地杆菌属（Terrabacter）、假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、红球菌属（Rhodococcus）等；革兰氏阴性PAH双加氧酶酶基因主要分布在从毛单胞菌属（Comamonas）、代尔夫特菌属（Delftia）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）、伯克氏菌属（Burkholderia）、假单胞菌属（Pseudomonas）葡萄球菌属（Staphylococcus）等。 【关键词】：典型工业废水 生物活性炭 454高通量测序 Q-PCR 微生物群落进化 降解PAH功能基因
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：X703;X172
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 前言12-32
• 1.1 我国水污染特点及现状12
• 1.2 我国典型工业废水特点及污染现状12-13
• 1.3 国内外对于典型工业废水深度处理的现状13-16
• 1.4 生物活性炭在废水深度处理中的作用机理及特性16-17
• 1.5 白腐真菌、酵母菌对造纸废水的降解作用机理17
• 1.6 污水处理系统中的微生物群落结构和多样性分析17-22
• 1.7 环境微生物常用的分子生态分析方法22-26
• 1.7.1 16srRNA 进行克隆文库的构建22-23
• 1.7.2 变性梯度凝胶电泳（DGGE）、温度梯度凝胶电泳（TGGE）23
• 1.7.3 基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）23-24
• 1.7.4 荧光定量 PCR（Q-PCR）24-25
• 1.7.5 454 高通量测序技术25-26
• 1.8 废水中难降解物多环芳烃（PAHs）的危害26
• 1.9 微生物对 PAHs 降解的代谢途径26-27
• 1.10 PAH 降解功能基因的研究现状27-28
• 1.11 本课题背景和意义28-30
• 1.12 本课题的技术路线30-32
• 第二章 摇瓶条件下种污泥适用于不同类型工业废水体系中的微生物群落进化研究32-58
• 2.1 前言32
• 2.2 材料与方法32-36
• 2.2.1 活性污泥样品采集32
• 2.2.2 水样采集32-33
• 2.2.3 实验室摇瓶废水处理体系的构建33
• 2.2.4 三种废水处理不同时期的样品简介33-34
• 2.2.5 DAPI 染色法对废水处理体系中微生物总数的分析34
• 2.2.6 废水处理体系中微生物菌群的实时定量分析（Q-PCR）34-36
• 2.2.7 454 高通量测序分析细菌群落的动态演替36
• 2.3 结果与讨论36-55
• 2.3.1 三种废水处理体系中的 COD 及色度的处理效果36-39
• 2.3.2 废水处理体系中生物相与活性污泥状态的相关性分析39-41
• 2.3.3 DAPI 染色对三种废水处理体系中的微生物总量的分析、基于 Q-PCR 的微生物丰度的动力学进化分析41-44
• 2.3.4 454 高通量测序分析微生物群落的动力学变化44-55
• 2.4 小结55-58
• 第三章 反应器条件下生物活性炭对造纸废水深度处理过程中的微生物群落进化及功能的研究58-76
• 3.1 前言58
• 3.2 材料与方法58-64
• 3.2.1 颗粒活性炭的预处理58
• 3.2.2 反应器构造58-59
• 3.2.3 实验室规模的废水处理小试系统的构建59-60
• 3.2.4 造纸废水水质指标60-61
• 3.2.5 Fenton 试剂氧化对造纸废水处理的方法61
• 3.2.6 生物活性炭基因组 DNA 的提取及样品简介61
• 3.2.7 降解 PAH 芳环羟基化双加氧酶基因功能的实时荧光定量（Q-PCR)分析61-63
• 3.2.8 降解 PAH 双加氧酶基因的克隆制备63-64
• 3.3 结果与讨论64-74
• 3.3.1 生物活性炭反应器对造纸废水的深度处理效果64-69
• 3.3.2 Fenton 试剂氧化与生物活性炭对造纸废水深度处理效果的比较69
• 3.3.3 Q-PCR 对生物活性炭中微生物菌群、降解 PAH 双加氧酶功能基因的定量分析69-73
• 3.3.4 生物活性炭中降解 PAH 双加氧酶功能基因的多样性分析73-74
• 3.4 小结74-76
• 第四章 结论与展望76-78
• 参考文献78-84
• 致谢84-85
• 攻读学位期间发表的学术论文目录85-86

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