聚环氧乙烷对脓毒血症休克大鼠脊斜肌微循环影响的实验研究

【摘要】：研究背景 严重感染所致的感染性休克是当前危重病医学中首位死亡因素,医疗耗费巨大。虽然近年来在抗生素的使用、重症临护、支持治疗等方面有了极大发展,但近10年死亡率并未出现下降趋势。严重感染与感染性休克时因缺氧和酸中毒致使微循环瘀滞,血浆外渗,致使有效循环血量减少,血流分布异常,同时炎症代谢产物与内毒素的直接损伤等可共同导致血压下降与组织器官灌注减少,其中缺氧和酸中毒时上述病理改变更为明显。微循环障碍和炎症反应是其重要病理生理基础,改善微循环和减轻炎症反应是影响预后的关键。持续的微循环恶化导致多器官功能衰竭,最终导致死亡。临床感染性休克治疗中,液体复苏是恢复血液动力学、组织／器官灌注的首要治疗措施,但是经过早期目标治疗后,即使容量已恢复,微循环的障碍仍可能继续存在。所以寻找一个更加有效的改善微循环的治疗方法迫在眉睫。早期研究发现,微循环成像越差的患者预后越差,微循环改善快的感染性休克患者存活率高于微循环改善慢的患者,在发生休克后尽早改善微循环将明显改善死亡率。 Toms等于上世纪50年代发现在流体中加入少量的高分子聚合物后,流动阻力明显降低,在不改变驱动压的情况下,流速增加。这种现象称为Toms效应(Toms effect)而这种高分子聚合物称为减阻剂。国内外多项研究报导减阻剂能够阻止延缓动脉粥样硬化的形成,有延缓糖尿病微血管病变、利尿及改善肾功能,减少机械作用对红细胞的机械损伤等。这些作用可能与以下几种机制有关。1：降低“血浆撇清效应(plasma skimming effect)",红细胞悬液在微血管里流动时,在近管壁处会产生一个相对少细胞的区域,这种现象为“血浆撇清”,加入减阻剂可以显著减少近管壁处的少红细胞血浆层的厚度,使红细胞重新分布于近管壁处,使得在动脉及毛细血管中血液-气体交换更便利；2：增加红细胞变形能力,使其更容易通过微循环；3：降低血浆流动雷诺系数,使血浆流动湍流减少,降低血管阻力；4：降低“法-林效应：(Farhaeus-Lindqvist effect)"逆转的临界半径可以使红细胞在通过更小的微循阻力降低从而增加红细胞向局部组织供氧； 自上世纪70年代减阻剂开始应用在医学研究中,其主要作用是改善血流动力学,近年来逐渐发现减阻剂在改善糖尿病动物微循环障碍、急性心肌缺血动物的预后,失血性休克的再灌注及液体复苏等方面都有一定的作用。国内外尚未见其在感染性休克微循环方面的研究。本研究拟建立大鼠脓毒血症休克模型,通过显微镜直接观察脊斜肌微循环变化,探究减阻剂对感染性休克大鼠骨骼肌微循环的影响。 材料与方法 1药品与试剂 聚环氧乙烷50000(PEO Sigma公司)；0.9%氯化钠注射液(山东鲁抗)；3%戊巴比妥钠(南方医院实验动物中心)。2仪器 监护仪(飞利浦MP60)；微量输注泵(德国贝朗)；纤维素膜透析袋(Spectrum公司)；正置荧光显微镜(ZEISS公司)+NIS-ELEMENT软件。3K30低温离心机(美国sigma公司)；8453紫光-可见分光光度计美国Agilent公司)；动脉压力传感器；漩涡振荡器MS3 3动物 雄性SPF级Wistar大鼠(南方医科大学动物中心提供)48只,体重180～200g。 4方法 4.1减阻剂制备 精确称取10mg PEO,加入10ml生理盐水,配制成浓度为1000ppm的溶液。将配好的PEO溶液装入分子截留量为40000Da的透析袋中,于生理盐水中透析24小时。用生理盐水将透析后的1000ppm溶液稀释为10ppm和50ppm存放于 4摄氏度冰箱备用。 4.2动物模型制备 在对脓毒症的研究中,人们通常采用注射致死量大肠杆菌、注射内毒素脂多糖(LPS)及CLP等方法建立脓毒症的动物模型。本实验感染模型采用盲肠结扎穿刺法(CLP)来建立, CLP模型是研究感染及相关疾病最常用的模型,是脓毒血症实验模型的金标准,能够比较真实的模拟感染的病理生理过程。此模型采用结扎盲肠末端并穿刺的方法,使肠内容物及菌群转移入血并引发机体炎症反应。方法：体重180-200g雄性大鼠,3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉,固定,备皮消毒。无菌手术。下腹部正中切口2cm,找出盲肠末端,结扎中下1/3处,(见图1)注意勿损伤血管。14号针头穿透并挤出少许肠内容物,保证穿孔穿通。(见图2)注意勿损伤肠系膜和血管。回纳肠管,勿使扭转避免梗阻,消毒切口缝合。术毕苏醒后放回观察,有脓毒血症休克表现后进行试验。每只动物手术操作和时间尽量保持一致,以使试验时模型感染程度尽量一致。在本研究中,CLP后大鼠逐渐出现萎靡、躁动、竖毛、腹泻等表现；处死动物后剖腹见腹腔有血性或脓性渗出液,带恶臭,肠管胀气,内脏充血水肿失去原有光泽；表明动物模型的复制是成功的。 4.3试验动物外科准备 动物有休克表现后(统一14小时后)。腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后,固定并暴露右侧腹股沟,右侧股动脉切开穿刺插管,连接动脉测压装置,持续监测动脉平均压。静脉插管进行补液。暴露背部皮肤,分离脊斜肌并将脊斜肌置于显微镜下观察微循环血流,持续滴入平衡液保持脊斜肌表面湿润。间隔进行录像采集局部微循环图像。 4.4模型分组及数据采集 模型随机分为4组,聚环氧乙烷低剂量组(PE01组)持续泵入生理盐水+10ppm聚环氧乙烷,聚环氧乙烷高剂量组(PE02组)持续泵入生理盐水+50ppm聚环氧乙烷,生理盐水对照组(NS组)持续泵入单纯生理盐水。复苏时间为4小时,速度均为15ml/kg/h,空白对照组(NT组)不进行液体复苏,复苏结束后缝合创口观察生存时间。在复苏开始前(T0)以及开始后10分钟(T10),30分钟(T30),60分钊,(T60),120分钟(T120)和240分钟(T240)记录微循环状态。并在开始复苏前,复苏结束后和存活72小时后采集血液测乳酸浓度并留存血清标本检测炎症因子和肝肾功能。血清保留方法：血浆抗凝后3000r/min离心10分钟取上清-80。冰箱保存。 4.5统计学处理 数据全部采用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料以x±s表示；组内前后对比采用重复测量数据的方差分析,组间比较采用One-Way NAOVA,检验标准以LSD方法,P0.05为差异有显著性。图表使用SPSS13.0和office2007制作。 结果 1对心率和血压的影响。 除NT组血压逐渐下降,在复苏结束时低于其余三组(p0.05),其余各组间血压心率均无明显变化。 2对大鼠脊斜肌小动脉管径和红细胞流速的影响。 四组在复苏前后及各组间比较血管管径并无显著变化,所测量血管的直径为37.20±7.75(μ m)。RBC流速PE01组给药后显著增快,10分钟时即达到峰值(2228.93±292.86vs3115.70±375.95p=0.000),其后持续给药可维持稳定,速度有所下降但不显著,复苏结束时明显快于复苏前(2228.9±292.9vs2759.7±215.7p=0.001)。PE02组给药后RBC流速同样显著加快,之后迅速下降致复苏前水平,并不能维持。NS组RBC流速减慢但不显著(p0.05)。NT组则持续下降,实验结束时(T240)显著低于实验开始时(T0)(p=0.004)。各组间相比,在给药10分钟后PE01组.PE02组RBC流速快于NS组和NT组(p0.05), PE02组在给药60分钟后速度下降至NS组和NT组水平(p0.05),而PE01组则维持较快的RBC流速至复苏结束。NS组间各时间点RBC流速无明显差异。而NT组结束时则要低于其余3组(p0.05)。3大鼠血浆IL-6、TNF-α和血乳酸浓度变化以及复苏4小时乳酸清除率。 血乳酸浓度除NT组复苏前后无明显变化,其余三组复苏后乳酸浓度均明显低于复苏前(p0.01),组间相比复苏后PE01组,PE02组和NS组三组血乳酸浓度均明显低于NT组(p0.05),相应的乳酸清除率也明显高于NT组(p0.05)。PE01组复苏后血乳酸浓度比NS组和PE02组稍低,但无统计学意义,而乳酸清除率是明显高于NS组和PE02组(p0.05)表1。而血浆IL-6和TNF-α浓度组间和组内比较均无明显变化(p0.05) 4大鼠最终生存时间变化。 每组12只大鼠纳入实验,PE01组72小时后存活5只,存活率为41.7%。NS组72小时后有2只存活,存活率为16.7%。PE02组仅有一只存活,存活率为8.3%。而NT组则没有一直存活超过48小时。平均生存时间PE01组53±5.7小时明显长于NT组的26±4.1小时和NS组的34±5.8小时。而PE02组为37±4.8小时,和NS组无明显差异。 结论 1.低浓度(10ppm)聚环氧乙烷能够加速血乳酸的清除,降低实验动物学乳酸浓度,改善脓毒血症休克大鼠预后,显著提高实验动物生存时间。 2.低浓度(10ppm)聚环氧乙烷对微循环管径没有影响,能够显著提高脓毒血症休克大鼠脊斜肌微循环血流速度 3.低浓度(10ppm)聚环氧乙烷在本实验条件下对脓毒血症休克大鼠血压及心率无明显影响。 【关键词】：聚环氧乙烷 脓毒血症 盲肠结扎穿刺 血流速度 炎症因子
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-20
• 第一章 前言20-34
• 第二章 材料和方法34-40
• 1 主要药品与试剂34
• 2 主要仪器设备34
• 3 实验动物来源34-35
• 4 聚环氧乙烷复苏液配制35
• 5 动物模型制备及实验外科准备35-37
• 6 模型分组及数据采集37
• 7 指标检测37-39
• 8 统计学处理39-40
• 第三章 结果40-57
• 1 对心率和血压的影响40-45
• 2 对大鼠脊斜肌小动脉管径和红细胞流速影响45-51
• 3 大鼠血浆IL-6、TNF-α和血乳酸浓度变化以及复苏4小时乳酸清除率51-55
• 4 大鼠最终生存时间55-57
• 第四章 讨论57-64
• 第五章 结论64-65
• 研究不足之处65-66
• 参考文献66-72
• 缩略词对照72-73
• 硕士期间发表论文情况73-74
• 致谢74-76
• 统计学审稿证明76

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