东北地区秸秆降解工程菌的选育及速腐菌剂的研制

【摘要】：我国年产秸秆总量已经超过了7亿吨,居世界第一位,由于缺乏有效的处理手段大量的秸秆被露天焚烧,造成了环境污染,浪费了宝贵的生物资源。而在众多秸秆利用的方法中,微生物菌剂处理秸秆有着较为独特的优势。微生物发酵秸秆可以提供高品质的饲料,微生物菌剂降解秸秆可以提高秸秆利用率,微生物菌剂堆肥秸秆可以提供高品质的有机肥料。而微生物处理的关键是需要优良的菌种。我国东北地区秸秆资源占全国的前三位,由于气温低等因素使其更加难于有效的利用,也更加缺乏优良的菌种。为了提高东北地区的秸秆利用率,本试验进行了东北地区秸秆降解工程菌的选育方面的研究,并制备了秸秆速腐菌剂。取得了以下主要成果： 1、利用多种微生物育种方法获得以下秸秆降解菌 从树林中腐烂的树叶、田间地头腐烂的秸秆、放牛场中腐败的牛粪、天然堆沤秸秆肥料中采集样品,利用CMC-Na平板初筛分离纯化培养后,筛选出了40株纤维素降解能力较强的菌株。利用刚果红透明圈法复筛获得了10株菌(H1-H10)。通过CMC酶活和滤纸酶活测定,结果显示酶活情况都很好。选取其中综合性能都好的6株菌,进行形态学和分子生物学鉴定,结果表明H2为假单孢杆菌；H1为缺陷短波单孢菌；H3为荧光单胞菌；H4为解淀粉芽孢杆菌；H7为铜绿假单胞菌；H6为解淀粉芽孢杆菌。 利用基因工程手段,克隆黑曲霉木聚糖酶基因xynB,并成功插入穿梭质粒,获得重组质粒pGAPz-xynB。PCR、双酶切及测序结果显示克隆的目的基因xynB正确,构建的重组质粒成功。将pGAPz-xynB利用电击法转入毕赤酵母X-33,使用博来霉素筛选得到阳性克隆,经PCR鉴定和SDS-PAGE鉴定,表明转入成功。通过对表达的木聚糖酶酶活测定显示,工程菌成功构建,胞外酶活性可达到8.33IU/mL。重组工程菌命名为PP-XYNB。 利用原生质体融合手段,对绿色木霉AS3.3711和康宁木霉AS3.2774进行了融合。首先研究了2种木霉菌原生质体的制备条件。试验结果表明,原生质体制备条件为：菌龄为22h,酶浓度为13mg/mL(0.5%溶壁酶+0.5%蜗牛酶+0.3%纤维素酶),酶解时间2h,渗透压稳定剂为STC,酶解温度31℃。在此条件下,原生质体制备率70%,再生率为62%。选取酶活力较高突变株,制备原生质体,再进行细胞融合,通过刚果红初筛和发酵产酶复筛,得到一株酶活力高,遗传稳定的突变株T-VK10。其CMC酶活达到119IU/ml。 利用分子生物学手段,以pMD18-T-35S.EGI.NOS为模板,将纤维素酶EGI基因、35S启动子、NOS终止子作为一个整体克隆出来,并将其插入到粟酒裂殖酵母表达系统的pESP-2的多克隆位点处,结果证明pESP-2-35S.EGI.NOS表达载体构建成功,将构建成功的载体导入到粟酒裂殖酵母菌体中,并使外源基因得到表达。最后获得了酶活性达16U/mL的表达纤维素酶粟酒裂殖酵母菌体,并命名为SP-EGI。 2、进行菌株的复合配比试验,并成功制备复合菌剂 利用平板培养法进行拮抗实验,结果证明实验室筛选的6株纤维素分解菌株,实验室保存的绿色木霉(TV)、康宁木霉(TK)、平菇菌丝(PO)、枯草芽孢杆菌(BS)、酿酒酵母(SC)、啤酒酵母(BY),工程改造的毕赤酵母(PP-XYNB)、粟酒裂殖酵母(SP-EGI)、原生质体融合菌T-VK10共15株菌之间没有明显的拮抗作用,均可以进行复合菌剂的复配实验。 将备选的15株菌进行正交实验,通过观察各种组合对液体培养基中滤纸条溃烂的情况,确定高效降解秸秆的最优菌种复合系为：假单孢杆菌(H2)+荧光单胞菌(H3)+解淀粉芽孢杆菌(H6)+枯草芽孢杆菌(BS)+毕赤酵母(PP-XYNB)+粟酒裂殖酵母(SP-EGI)+原生质体融合菌(T-VK10)。 制备复合菌剂干粉,通过单因素试验筛选了20种常见的干燥保护剂,其中效果突出的是海藻糖、吐温80、司班60,效果最好的是海藻糖。通过正交试验设计,得出5%海藻糖、2%吐温80、2%司班60干燥剂组合保护效果最好,CMAP活菌率可以达到83.39%；另外2%司班60、2%吐温80的干燥剂组合效果也不错,CMAP活菌率达到77.43%,完全可以进行工业化生产,关键是其造价低廉。最后确定了CMAP生产条件：培养到适当菌龄的菌液按比例混合,加入2%吐温80、2%司班60为干燥剂,利用板框压滤机压榨到含水率低于65%,挤出造粒Φ1mm×2mm,干燥温度90℃,最终含水率7%左右。 3、通过功效验证,自制的复合菌剂综合性能优良 通过堆肥试验验证复合菌剂的功效,结果显示：添加复合菌剂的实验组堆温升高为最快,在第4天进入了高温发酵期,并于第7天达到了最高温度64℃。比CK2先进入高温期5天左右,而且高温期的温度也比CK2高出约13℃,缩短了腐熟时间,并且有利于有害病菌的死亡。堆肥pH值测定结果：实验组堆肥的pH值在7天以后就处于7.4-8.0之间,优于CK2和CK1,这样的偏碱环境下非常有利于微生物降解秸秆,利于堆肥品质的提高。 通过平板计数法测定各堆肥处理在不同堆肥时间各种相关微生物变化,结果表明：堆肥过程中以好气细菌、兼气细菌数量的增长最为迅速。其次以产纤维素酶的菌株、放线菌生长最快,有利于玉米秸秆的降解。实验组较空白对照而言,堆体中微生物数量明显较多,实验组和CK2微生物数量比CK1高出一个数量级,而实验组又比CK2高出30%以上,大量的微生物繁殖使堆温上升较快且温度高,高温期持续时间较长,能明显促进堆肥腐熟。接种外源菌剂对细菌、真菌、放线菌的数量变化与自然堆肥相比有显著的影响。 通过对各处理不同时段采样测定有效元素,实验结果表明：实验组有效氮的含量先增后减,表明了微生物大量繁殖和作用的过程,总的来讲,有效氮含量是增加的。从总体来看,有效钾在堆肥过程中的变化不大,实验组和CK2有效钾的含量高于CK1,实验组比CK2略好。堆肥过程中速效磷的变化较大,三个处理堆肥后都比堆肥前提高较多,以实验组增加最为明显,实验组高出对照组69.41%。 【关键词】：秸秆降解 工程菌 复合菌剂 堆肥
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：S141.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 前言12-31
• 1.1 概述12
• 1.2 东北地区秸秆综合利用现状12-15
• 1.3 秸秆速腐菌剂的研究进展15-18
• 1.4 降解木质纤维素类微生物菌种选育的研究进展18-20
• 1.5 木聚糖酶及pGAP-毕赤酵母表达系统研究进展20-24
• 1.6 纤维素酶及原生质体融合育种研究进展24-25
• 1.7 粟酒裂殖酵母表达系统及35S启动子的研究进展25-27
• 1.8 秸秆速腐菌剂的功能鉴定技术研究进展27-29
• 1.9 研究的目的及意义29-31
• 第二章 秸秆降解菌菌种选育31-83
• 2.1 秸秆降解菌株的自然分离与鉴定31-42
• 2.1.1 材料与方法31-35
• 2.1.1.1 材料、培养基、试剂、仪器31-32
• 2.1.1.2 纤维素降解菌的筛选32
• 2.1.1.3 秸秆降解菌酶活测定32-33
• 2.1.1.4 秸秆降解菌菌株的鉴定33-35
• 2.1.2 结果与分析35-42
• 2.1.2.1 纤维素降解菌的筛选结果35-36
• 2.1.2.2 纤维素酶活测定结果36-37
• 2.1.2.3 菌株的形态学检测结果37-38
• 2.1.2.4 分子生物学鉴定结果38-42
• 2.2 构建高效表达木聚糖酶的毕赤酵母菌株42-60
• 2.2.1 材料与方法43-54
• 2.2.1.1 材料、试剂、培养基、仪器43-44
• 2.2.1.2 克隆木聚糖酶xynB基因44-47
• 2.2.1.3 构建重组表达载体及鉴定47-49
• 2.2.1.4 pGAPz-xynB重组质粒转化毕赤酵母49-51
• 2.2.1.5 重组工程菌的鉴定51-53
• 2.2.1.6 重组工程菌的酶活测定53-54
• 2.2.2 结果与分析54-60
• 2.2.2.1 木聚糖酶基因xynB的克隆54-56
• 2.2.2.2 重组表达载体的鉴定56-58
• 2.2.2.3 重组毕赤酵母工程菌鉴定58-59
• 2.2.2.4 DNS法测定重组工程菌酶活59-60
• 2.3 原生质体融合获得高产纤维素酶菌株60-71
• 2.3.1 材料与方法60-64
• 2.3.1.1 菌株、培养基、试剂、仪器60-61
• 2.3.1.2 菌种保存与选择61
• 2.3.1.3 原生质体的制备与再生61-62
• 2.3.1.4 原生质体的初级诱变、融合与筛选62
• 2.3.1.5 纤维素酶活测定62-63
• 2.3.1.6 融合子的遗传稳定性检验及鉴定63-64
• 2.3.2 结果与分析64-71
• 2.3.2.1 原生质体的制备与再生64-66
• 2.3.2.2 原生质体的初级诱变、融合、筛选66-68
• 2.3.2.3 融合子产酶量、稳定性检验及融合子的鉴定68-71
• 2.4 构建高效表达纤维素酶的粟酒裂殖酵母菌株71-81
• 2.4.1 材料与方法71-77
• 2.4.1.1 材料、培养基、试剂、仪器71-72
• 2.4.1.2 35S.EGI.NOS基因的克隆72-73
• 2.4.1.3 粟酒裂殖酵母重组表达载体的构建及鉴定73-75
• 2.4.1.4 粟酒裂殖酵母重组表达载体质粒DNA的转化与鉴定75-77
• 2.4.1.5 重组酵母转化子的刚果红染色筛选及酶活测定77
• 2.4.2 结果与分析77-81
• 2.4.2.1 目的基因的克隆与表达载体的构建78-79
• 2.4.2.2 重组粟酒裂殖酵母筛选与鉴定79-80
• 2.4.2.3 纤维素酶基因在粟酒裂殖酵母中的表达80-81
• 2.5 小结与讨论81-83
• 第三章 秸秆降解菌复合菌剂的制备与功能鉴定83-109
• 3.1 构建秸秆降解菌复合菌剂及其功能鉴定83-102
• 3.1.1 材料与方法84-90
• 3.1.1.1 菌种、培养基、试剂、仪器84-85
• 3.1.1.2 复合菌剂的组合筛选85-86
• 3.1.1.3 利用堆肥对秸秆速腐菌复合菌剂进行功能验证86-87
• 3.1.1.4 温度及pH测定87
• 3.1.1.5 微生物数量测定87
• 3.1.1.6 有效养分的测定87-90
• 3.1.2 结果与分析90-102
• 3.1.2.1 菌株间的拮抗关系测定及复合菌剂构建结果90-91
• 3.1.2.2 温度及pH值的测定结果与分析91-93
• 3.1.2.3 微生物数量测定与分析93-97
• 3.1.2.4 有效养分的测定结果与分析97-102
• 3.2 秸秆速腐菌活性干粉生产工艺优化及干燥剂的选择102-107
• 3.2.1 材料与方法102-104
• 3.2.1.1 菌种、培养基、试剂、仪器103
• 3.2.1.2 CMAP制备及参数检测103-104
• 3.2.1.3 干燥温度对活菌率的影响104
• 3.2.1.4 筛选干燥保护剂104
• 3.2.2 结果与分析104-107
• 3.2.2.1 干燥温度试验结果与分析105
• 3.2.2.2 筛选干燥保护剂试验结果与分析105-106
• 3.2.2.3 正交试验优化干燥保护剂的组合结果与分析106-107
• 3.3 小结与讨论107-109
• 第四章 结论与展望109-111
• 参考文献111-119
• 附录119-124
• 致谢124-125
• 个人简介125

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