基于混合菌群的水稻秸秆丁酸发酵过程优化与机制研究

【摘要】：木质纤维素类生物质的储量巨大，以其为原料的生物基产品及其生产技术对于化工产业的持续发展、能源安全保障和环境保护均具有重要意义，发展前景广阔。在木质纤维素的生物转化过程中，其水解糖化是关键技术之一，目前最为有效的方法是酶解。然而，高昂的酶制剂极大地限制了以木质纤维素为原料的生物基产品生产技术的发展。而基于混合菌群的发酵，无需使用昂贵的纤维素酶就能将木质纤维素原料转化为各种化学品。丁酸被广泛应用于化工、食品饮料和制药等行业，还可进一步转化为生物燃料丁醇，是一种高附加值的生物基产品，但其生物转化的商品化进程受到酶解糖化成本高、发酵副产物多及产率低等问题的严重制约。本文以开发避免使用纤维素酶试剂的基于混合菌群的木质纤维素生物质丁酸发酵技术为目标，进行了水稻秸秆的预处理、丁酸发酵混合菌群的选育、丁酸发酵系统的构建及效能调控等研究，并从微生物学、生理生态学和代谢调控等方面探讨了混合菌群发酵秸秆产丁酸的机理。 研究采用碱对水稻秸秆进行预处理，在50℃条件下，经1%氢氧化钠溶液浸泡72h，木质素去除率可达66%左右，而84%的纤维素和71%的半纤维素得到保留。同时，以牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木等为出发菌群，经过8个月的传代富集与筛选，获得一个具有稳定的纤维素、半纤维素利用能力和高丁酸产率的混合菌群，其微生物组成以纤维素降解菌、木聚糖降解菌、丁酸发酵菌以及其他产酸发酵菌为主。该菌群以氢氧化钠预处理水稻秸秆为底物，获得了6g/L的丁酸产量，占总挥发性脂肪酸的76%，与理论上丁酸梭菌（Clostridium butyricum）和酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）发酵葡萄糖的丁酸比例相当，表明该菌群在发酵水稻秸秆产丁酸方面具有很好的潜力。 为了提高所选育的混合菌群发酵水稻秸秆的产丁酸能力，对pH值与缓冲剂、产甲烷抑制剂以及发酵模式进行了研究。结果表明，采用CaCO3与NaHCO3组合作为缓冲剂将发酵系统pH值控制于6.0～6.5之间对于丁酸发酵最为适宜，可获得7.3g/L的丁酸产量。在发酵系统中加入0.08g/L的氯仿可完全避免产甲烷的发生，且不会对系统丁酸发酵能力产生不利影响。在各种发酵模式中，重复分批发酵模式会使系统中的副产物增加，而目标产物丁酸的产率逐批下降，不适于混合菌群的丁酸发酵。相对于分批发酵，补料分批发酵在提高发酵液丁酸浓度方面更具优势。通过排发酵液再补料的发酵方式，可以缓解产物和钠离子的抑制作用以及发酵菌种的老化。 补料分批发酵模式下，在有效容积为20L的搅拌槽式反应系统中，混合菌群表现出了较强的发酵秸秆产酸能力。控制发酵系统pH于6.0～6.5，每天排料3L后补料3L（90g/L的预处理秸秆），总挥发酸和丁酸产量可分别达到28.5和16.1g/L，甚至高于许多已报道的纯菌种发酵葡萄糖或蔗糖时的产量。其中，秸秆的丁酸转化率可达理论值的35%，总挥发酸实际产率（以乙酸当量计）更是高达理论值的64%。PCR-DGGE分析表明，混合菌群在补料分批发酵过程中保持了群落构成的相对稳定，纤维素和半纤维素降解菌、氨基酸降解菌、丁酸发酵菌及其他产酸发酵菌的共同作用和相互制约机制，为秸秆发酵产丁酸的高效性奠定了微生物基础。 分析认为，所选育混合菌群可通过以下两个机制获得较高的丁酸转化率和产量：（1）混合菌群在秸秆发酵过程中，可通过丁酸发酵与乙酸发酵的平衡调节机制提高丁酸的产率。在发酵初期，混合菌群主要产生乙酸以获得更多的ATP用于微生物生长。随着乙酸生成的增加，NADH+H+过剩，发酵系统的pH下降，发酵液中的乙酸被细胞重新吸收并转化成丁酸。同时，乙酸发酵受到限制，而丁酸发酵则得到加强，从而减少了酸性末端和NADH+H+的形成。如此，通过乙酸发酵和丁酸发酵的平衡调节，使得发酵系统能够达到生理生态上的平衡，并保证了较高的丁酸产率。（2）在混合菌群产酸发酵系统中，混合菌群可通过初级发酵途径和次级发酵途径产生丁酸，是混合菌群高效发酵秸秆产丁酸的另一个机制。在初级发酵中，细菌转化单糖或纤维素生成丁酸；在次级发酵中，细菌利用乙酸或乙醇通过加链反应生成丁酸，也可通过乳酸的氧化生成丁酸。 【关键词】：混合菌群 水稻秸秆 丁酸发酵 过程优化 补料分批发酵 机制
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X712;X172
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-14
• 第1章 绪论14-34
• 1.1 课题背景及研究的目的和意义14-15
• 1.2 发酵法丁酸生产技术的研究现状15-18
• 1.2.1 现有丁酸生产工艺及其可持续性分析15
• 1.2.2 丁酸发酵菌种及其代谢途径15-17
• 1.2.3 丁酸生物转化存在的问题17
• 1.2.4 丁酸生物转化的发展对策17-18
• 1.3 农作物秸秆资源化利用研究现状18-26
• 1.3.1 我国主要农作物秸秆资源储量估算18-20
• 1.3.2 农作物秸秆的处置与资源化利用现状20-21
• 1.3.3 农作物秸秆的生物基产品开发技术与策略21-23
• 1.3.4 秸秆的化学组成及预处理技术23-26
• 1.4 混合菌群发酵产丁酸的生理生态学研究26-31
• 1.4.1 秸秆的厌氧产酸发酵过程26-27
• 1.4.2 产酸发酵类型及其优势种群27-28
• 1.4.3 丁酸型发酵的稳定性28-29
• 1.4.4 混合菌群发酵产酸反应器及工艺29-31
• 1.5 本文的主要研究内容31-34
• 1.5.1 课题来源31
• 1.5.2 研究内容与技术路线31-34
• 第2章 试验材料与方法34-43
• 2.1 试验仪器与试剂34-35
• 2.1.1 主要试验仪器34
• 2.1.2 试验试剂34-35
• 2.2 检测项目与分析方法35-40
• 2.2.1 产气速率及其组分分析35
• 2.2.2 液相末端发酵产物的检测35
• 2.2.3 水稻秸秆理化性质分析35-36
• 2.2.4 微生物相关测定与分析36-39
• 2.2.5 数据处理39-40
• 2.3 实验方法40-43
• 2.3.1 水稻秸秆的预处理40
• 2.3.2 纤维素酶解实验40
• 2.3.3 菌群的传代富集40-41
• 2.3.4 接种物制备41
• 2.3.5 分批发酵和重复分批发酵41
• 2.3.6 pH控制41
• 2.3.7 甲烷菌的抑制41
• 2.3.8 水稻秸秆的补料41-42
• 2.3.9 搅拌槽式反应器的运行42-43
• 第3章 水稻秸秆的预处理与丁酸发酵菌群的选育43-57
• 3.1 引言43
• 3.2 水稻秸秆的氢氧化钠预处理43-48
• 3.2.1 氢氧化钠预处理对水稻秸秆组分的影响43-44
• 3.2.2 氢氧化钠预处理对水稻秸秆酶解的影响44-45
• 3.2.3 氢氧化钠预处理对水稻秸秆丁酸发酵的影响45-47
• 3.2.4 氢氧化钠预处理对水稻秸秆微观结构的影响47-48
• 3.3 发酵水稻秸秆产丁酸菌群的富集与筛选48-52
• 3.3.1 发酵水稻秸秆产丁酸菌群的初筛48-49
• 3.3.2 发酵水稻秸秆产丁酸菌群的复筛49-52
• 3.4 发酵水稻秸秆产丁酸菌群的结构解析52-56
• 3.5 本章小结56-57
• 第4章 混合菌群发酵水稻秸秆产丁酸的过程优化57-91
• 4.1 引言57
• 4.2 分批发酵和重复分批发酵效能的比较57-62
• 4.2.1 挥发酸产量及发酵过程特征57-60
• 4.2.2 副产物特征与比较分析60-61
• 4.2.3 菌群结构的变化特征与比较分析61-62
• 4.3 pH的调控与优化62-73
• 4.3.1 pH对丁酸发酵效能的影响63-66
• 4.3.2 缓冲剂对丁酸发酵效能的影响66-70
• 4.3.3 pH和缓冲剂对菌群结构的影响70-73
• 4.3.4 适宜pH及其调控对策73
• 4.4 产甲烷作用的抑制73-80
• 4.4.1 氯仿对丁酸发酵的影响73-76
• 4.4.2 2-溴乙烷磺酸对丁酸发酵的影响76-79
• 4.4.3 氯仿和2-溴乙烷磺酸对菌群结构的影响79-80
• 4.4.4 适宜产甲烷抑制剂及其调控对策80
• 4.5 水稻秸秆的补料与调控80-84
• 4.5.1 补料方式对丁酸发酵特征的影响80-83
• 4.5.2 补料方式对菌群结构的影响83-84
• 4.5.3 补料调控对策的确定84
• 4.6 发酵系统的构建及操作模式的选择84-89
• 4.6.1 发酵系统的构建84-85
• 4.6.2 分批发酵效能与特征85-87
• 4.6.3 补料分批发酵效能与特征87
• 4.6.4 分批发酵与补料分批发酵特性的比较分析87-89
• 4.7 本章小结89-91
• 第5章 混合菌群发酵水稻秸秆产丁酸效能及机制分析91-107
• 5.1 引言91
• 5.2 混合菌群产酸发酵的效能分析91-97
• 5.2.1 木质纤维素生物质的转化效能91-94
• 5.2.2 混合菌群与纯菌丁酸发酵特性的对比分析94-95
• 5.2.3 水稻秸秆发酵产丁酸的潜力分析95-97
• 5.3 混合菌群丁酸发酵的机制分析97-106
• 5.3.1 优势菌群的更迭98-101
• 5.3.2 优势菌群的解析101-104
• 5.3.3 乙酸发酵与丁酸发酵平衡机制104-105
• 5.3.4 丁酸的次级发酵机制105-106
• 5.4 本章小结106-107
• 结论107-109
• 参考文献109-121
• 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果121-123
• 致谢123-124
• 个人简历124

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