水稻秸秆木质素合成关键酶基因RNA干涉调控研究

【摘要】： 木质素是自然界中蕴藏丰富的天然有机物,并且在以每年500亿吨的速度再生。然而由于其自身结构以及目前人类对其利用能力的限制,迄今为止,超过95%的木质素都在以“黑液”直接排入江河或浓缩后烧掉,这不仅阻碍了作物秸杆类废弃物资源的利用,而且对环境造成污染。因此通过基因调控手段,培育低木质素含量的作物新品种,对提高秸秆类废弃物资源的利用效率,减少环境污染具有重要意义。 RNA干涉是一种重要的基因沉默方式,本研究通过RNAi技术抑制木质素合成关键酶基因4CL基因、C4H基因、C4HL基因表达,获得以下实验研究结果: 1.利用PCR技术克隆了4CL、C4H基因及这两个基因重组的C4HL三个cDNA片段,大小分别为:C4H1 300bp,4CL6 339bp及4CHL 639bp。 2.构建了C4H1、4CL6、C4HL三个RNAi表达载体,并用农杆菌介导的方法对水稻品种中花11进行转化,获得4CL6转化植株30株;C4H1转化植株60株;C4HL转化植株60株。 3.通过对T0代转基因植株农艺性状分析,发现转4CL RNAi片段的水稻植株出现大面积倒伏、株高较野生型CK矮小、水稻产量大幅度下降;转C4H、4CHL RNAi片段的植株与CK植株在株高和产量农艺性状上无显著差异。 4.测定T0代转基因植株成熟期秸秆木质素含量显示,CK、4CL、C4HL和C4H植株秸秆中叶的木质素含量分别为:13.1435%、9.2921%、11.517%和8.5465%;茎的木质素含量分别为:14.86238%、11.0577%、12.88238%和10.1499%;秸秆总木质素含量分别为14.00294%、10.1749%、12.19969%和9.3482%。转基因植株T0代木质素含量比野生型CK植株平均下降14%-35%,表明通过RNAi转化可抑制4CL、C4H基因表达降低水稻秸秆中木质素含量。 5.综合分析转基因水稻农艺性状及抑制木质素合成能力,结果初步表明RNA干涉C4H基因可在不显著影响水稻植株正常生长的情况下有效降低秸秆木质素含量,C4H片段可作为降低秸秆木质素代谢的RNAi目标基因。 【关键词】：水稻 RNA干涉 农艺性状 木质素 C4H
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：S511
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 1 文献综述8-19
• 1.1 木质素的结构和性质8-9
• 1.2 木质素的应用9
• 1.3 木质素合成途径及基因调控9-12
• 1.3.1 木质素合成途径9-10
• 1.3.2 木质素合成基因调控10-12
• 1.4 RNAi12-17
• 1.4.1 RNAi 历史发展12-13
• 1.4.2 RNAi 作用机制13-14
• 1.4.3 RNAi 与植物研究上的应用14-17
• 1.5 木质素含量的检测17-19
• 1.5.1 检测木质素含量的方法17-19
• 2 引言19-20
• 3 材料和方法20-33
• 3.1 实验材料20-21
• 3.1.1 植物材料20
• 3.1.2 菌株和载体20
• 3.1.3 酶及试剂20
• 3.1.4 引物设计20-21
• 3.1.5 培养基21
• 3.2 仪器设备21-22
• 3.3 研究方法22-33
• 3.3.1 调控木质素合成基因C4H1、4CL6 的克隆22-26
• 3.3.2 调控木质素合成基因C4H1、4CL6、4CHL RNAi 载体的构建26-29
• 3.3.3 农杆菌介导法转化水稻29-30
• 3.3.4 水稻的转化及遗传分析30-32
• 3.3.5 阳性苗室外培育32
• 3.3.6 T_0 代转基因水稻的检测32-33
• 4 结果和分析33-48
• 4.1 表达载体的构建33-36
• 4.1.1 C4H1-PHact 载体构建33-34
• 4.1.2 4CL6-PHact 载体构建34-35
• 4.1.3 4CHL-PHact (double gene)载体构建35-36
• 4.2 含表达载体农杆菌的检测36-38
• 4.2.1 C4H1-PHact 的检测36-37
• 4.2.2 4CL6-PHact 的检测37
• 4.2.3 4CHL-PHact 的检测37-38
• 4.3 水稻的转化及遗传分析38-48
• 4.3.1 农杆菌介导的水稻转化38
• 4.3.2 T_0 转基因水稻苗的检测38-40
• 4.3.3 T_0 转基因水稻农艺性状分析及田间生长状况对比40-48
• 5 讨论48-50
• 6 结论50-51
• 参考文献51-57
• 致谢57-58
• 作者简介58

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