漆酶高产菌株选育及其降解秸秆木质素机理研究

【摘要】： 本试验选择以担子纲白腐真菌(Pleurotus ostreatus WY-01)为出发菌株,利用N+注入技术对其进行诱变选育,获得一株高产漆酶诱变菌株WY-02。运用正交实验设计对其固体发酵培养基和发酵条件进行优化,采用红外光谱法探讨诱变菌株WY-02对油菜秸秆中木质素的生物降解机制。 对白腐真菌(Pleurotus ostreatus WY-01)进行N+注入的结果表明:当N+注入剂量为80×2.6×1014ions/cm2时,孢子存活率回升到26%,并且在该剂量下孢子正突变率达到最大,因此确定80×2.6×1014ions/cm2为最佳N+注入剂量。经过N+反复的注入诱变筛选,突变高产菌株WY-02的漆酶活力由出发菌(Pleurotus ostreatus WY-01)的最高峰值酶活4.17U/g提高到12.5U/g。突变菌株WY-02经传5代培养,产酶性能稳定。 采用单因素试验和正交试验对突变菌株WY-02产漆酶的固体培养基进行优化,确定突变菌株的最佳产酶培养基为:葡萄糖10g/L,酒石酸铵0.2 g/L,硫酸铜0.015g/L。优化后培养基最适发酵条件:发酵温度为28℃,培养基起始pH为4.5,接种量为每15g油菜秸秆粉3个菌塞(φ12mm),诱导剂用1mmol/L ABTS。经过上述产酶条件的优化,突变菌株WY-02的产酶峰值可达15.3 U/g。 对诱变菌株降解后的油菜秸秆中木质素官能团的变化采用红外光谱法进行分析,探索诱变菌株对油菜秸秆中木质素的生物降解机制。从图谱可以看出,1635cm-1处表征木质素中与苯环相连的C=O伸缩振动明显减弱;苯环的特征吸收峰(1515cm-1)由尖峰变为小的肩峰;表征木质素中CH2变形振动的吸收峰(1460cm-1)变得不明显;1324cm-1处的吸收峰明显增强;具有木质素的特征苯环取代物,其谱峰分别为1241cm-1(紫丁香基的C—O)和1057cm-1(愈创木基的O-H)处的振动减弱。从以上分析可以看出,油菜秸秆经诱变菌株降解,其木质素结构发生明显的变化。不仅木质素与苯环相连的C=O键、木质素侧链上CH2结构以及木质素单体(紫丁香基和愈创木基)被部分降解,并且木质素的苯环结构也遭到破坏。这表明油菜秸秆在诱变菌株降解过程中结构性碳水化合物逐步分解,木质纤维素中的环状结构被裂解成链状结构,从而使羟基、亚甲基数目不断增多,这说明白腐菌诱变菌株在降解油菜秸秆木质素方面有独特的优势,有利于高木质化秸秆的降解。 【关键词】：N~+注入 白腐真菌 漆酶 木质素
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：S816
【目录】：

• 中文文摘3-4
• 英文文摘4-9
• 文献综述9-18
• 1 生物降解木质素的研究9-11
• 1.1 木质素在植物中的存在形式9-10
• 1.2 降解木质素的微生物10-11
• 1.2.1 细菌类10
• 1.2.2 真菌类10-11
• 1.3 红外吸收光谱法鉴定木质素分子结构11
• 2 白腐真菌的研究进展11-14
• 2.1 白腐真菌的生物学背景11-12
• 2.2 白腐真菌木质素降解酶系12
• 2.3 白腐真菌降解木质素的机理12-13
• 2.4 白腐真菌降解木质素的应用13-14
• 2.4.1 农作物秸秆的饲料化13
• 2.4.2 造纸工业13-14
• 2.4.3 食品工业14
• 2.4.4 生物堆肥14
• 3 离子注入技术在微生物诱变育种方面的应用14-15
• 4 漆酶及其应用15-18
• 4.1 漆酶的组成和结构特征15
• 4.2 影响白腐真菌漆酶活性的因素15-16
• 4.2.1 温度对漆酶活性的影响15-16
• 4.2.2 pH 对漆酶活性的影响16
• 4.2.3 Cu~(2+)对漆酶活性的影响16
• 4.2.4 诱导剂对漆酶活性的影响16
• 4.3 漆酶的定量分析方法16-18
• 4.3.1 用分光光度计测定漆酶的活力16-17
• 4.3.2 用微量热法测定漆酶酶活17
• 4.3.3 HAA 检测法17-18
• 引言18-19
• 1 材料与方法19-24
• 1.1 试验材料19-20
• 1.1.1 出发菌株19
• 1.1.2 试剂与溶液19-20
• 1.1.3 试验仪器20
• 1.1.4 培养基20
• 1.2 试验方法20-24
• 1.2.1 菌株的活化及保存20-21
• 1.2.2 单孢子悬液的制备21
• 1.2.3 离子注入21
• 1.2.4 孢子存活率的测定21
• 1.2.5 孢子突变率的测定21
• 1.2.6 木质素酶活性的平板试验21
• 1.2.7 粗酶液的制备21
• 1.2.8 诱变菌株最佳产酶培养基的研究21-22
• 1.2.9 诱变菌株产漆酶条件的优化22
• 1.2.10 漆酶活性的测定22
• 1.2.11 诱变菌株WY-02降解油菜秸秆木质纤维素的研究22-23
• 1.2.12 数据处理23-24
• 2 结果与分析24-36
• 2.1 N~+注入剂量参数的确定24-25
• 2.1.1 N~+注入剂量对孢子存活率的影响24
• 2.1.2 N~+注入剂量对孢子突变率的影响24-25
• 2.2 有益诱变菌株的获得25-26
• 2.3 白腐菌诱变菌株WY-02 产酶的稳定性26-27
• 2.4 最佳产酶培养基的研究27-30
• 2.4.1 不同碳源对诱变菌株WY-02 产漆酶的影响27
• 2.4.2 不同氮源对诱变菌株WY-02 产漆酶的影响27-28
• 2.4.3 白腐真菌诱变菌株WY-02 产酶培养基的优化28-30
• 2.5 发酵条件对诱变菌株WY-02 产酶性能的影响30-32
• 2.5.1 培养温度对诱变菌株WY-02 产漆酶的影响30
• 2.5.2 起始pH 对诱变菌株WY-02 产漆酶的影响30-31
• 2.5.3 不同接种量对诱变菌株WY-02 产漆酶的影响31
• 2.5.4 不同诱导剂对诱变菌株WY-02 产漆酶的影响31-32
• 2.6 诱变菌株WY-02 降解油菜秸秆木质素机制的研究32-36
• 2.6.1 秸秆中木质纤维素的降解规律32-33
• 2.6.2 红外光谱分析33-36
• 3 讨论36-40
• 3.1 N~+注入剂量对孢子存活率的影响36
• 3.2 N~+注入剂量对孢子突变率的影响36
• 3.3 固体发酵培养基对诱变菌株WY-02 产酶性能的影响36-37
• 3.4 不同发酵条件对诱变菌株WY-02 产酶性能的影响37-38
• 3.5 诱变菌株WY-02 降解油菜秸秆木质素机制的研究38-40
• 3.5.1 秸秆中木质纤维素的降解规律38-39
• 3.5.2 诱变菌株WY-02 对油菜秸秆木质纤维素官能团的降解39-40
• 结论40-41
• 参考文献41-47
• 致谢47-48
• 作者简介48
• 在读期间发表的学术论文48

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