秸秆纤维素的酶解及Bacillus. sp. bs-1的内切葡聚糖酶基因克隆和表达研究

【摘要】： 纤维素类物质是自然界中存在的最廉价、最丰富的一类可再生资源。对解决当今世界所面临的环境污染、粮食短缺、饲料资源紧张和能源危机等问题具有重大现实意义。 纤维素酶是指能水解纤维素β-1,4-葡萄糖苷键,使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称,它不是单一酶,而是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶的作用机制至今尚不完全清楚。能够产生纤维素酶的微生物的产酶能力低下,且所产生的酶的组分不全或不平衡。目前大部分纤维素酶基因的表达水平较低。纤维素酶基因工程的主要难题是如何实现不同组分的有效表达和如何提高表达量。 本文首先对甜高粱秸杆进行了各种预处理,包括机械处理、高温处理、无机溶剂处理、有机溶剂处理和超声波处理。之后用纤维素酶进行降解,用DNS法来确定产生还原糖的浓度,分析和比较各种预处理效果,从而得出以下结论,即在干燥高温条件下处理效果最好,超声波的处理效果也相对较高,稀酸碱的处理效果相对较弱。 从内蒙古乌拉特前旗乌梁素海附近一造纸厂附近取的泥样,用选择性培养基CMC-Na培养基和鉴定活力的刚果红培养基,筛选纯化出一株高酶活的纤维素降解菌。然后对该细菌用16S rDNA的方法进行分子鉴定,结果与NCBI数据库进行BLAST,其16S基因与枯草芽孢杆菌同源性达到98%,并通过显微镜的形态观察可断定为该菌属于芽孢杆菌属,将其命名为bs-1。 以芽孢杆菌bs-1的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到含有内切葡聚糖酶基因的DNA片段,将其连接到pMD19-T载体中,序列分析表明,克隆得到的DNA片段全长1503 bp,编码一个含有500个氨基酸的多肽。与其他芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因序列比对,其核苷酸同源率为93% ~96%,其编码的氨基酸序列的同源性在95% ~98%。将含内切葡聚糖酶基因的重组质粒pMD19-T-C进行提取,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a(+)相连接,构建了重组表达载体pEt-30a-C,并转化到表达宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行了诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果表明在大约55KD的位置上有表达的蛋白质条带。经DNS法测定表达的内切葡聚糖酶的活力为270 U/mL,为出发菌(175.54U/mL)的1.5倍。 【关键词】：预处理 芽孢杆菌 纤维素酶 克隆 原核表达
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 1 引言10-17
• 1.1 纤维素简介10-11
• 1.1.1 纤维素的分子结构10
• 1.1.2 植物秸秆纤维素的预处理10-11
• 1.2 纤维素酶的研究进展11-14
• 1.2.1 纤维素酶的组成及分类11
• 1.2.2 纤维素酶的结构及作用机理11-12
• 1.2.3 产纤维素酶的主要微生物群类12
• 1.2.4 产纤维素酶菌株的筛选12-13
• 1.2.5 纤维素酶在分子生物学中的研究进展13-14
• 1.3 纤维素预处理及纤维素酶研究的目的和意义14-17
• 1.3.1 纤维素预处理的目的和意义14-15
• 1.3.2 纤维素酶研究的目的和意义15-17
• 1.3.2.1 纤维素酶对动物营养的影响15
• 1.3.2.2 纤维素酶对造纸工业的影响15-16
• 1.3.2.3 纤维素酶对洗涤工业的影响16-17
• 2 材料与方法17-36
• 2.1 实验材料17-22
• 2.1.1 样品采集与处理17
• 2.1.2 主要试剂与试剂盒17-18
• 2.1.3 主要仪器18
• 2.1.4 引物18
• 2.1.5 培养基配方18-19
• 2.1.6 主要溶液19-22
• 2.2 实验方法22-36
• 2.2.1 甜高粱秸秆的预处理22-23
• 2.2.1.1 机械处理22
• 2.2.1.2 高温处理22
• 2.2.1.3 超声波处理22
• 2.2.1.4 酸碱处理22
• 2.2.1.5 有机溶剂处理22-23
• 2.2.2 纤维素酶活的测定（DNS 法）23-24
• 2.2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作23
• 2.2.2.2 纤维素酶的活性测定采用DNS 法23-24
• 2.2.3 高效降解纤维素的细菌的筛选24
• 2.2.4 菌株的165 rDNA 分子鉴定24-29
• 2.2.4.1 细菌总DNA 的提取24-25
• 2.2.4.2 扩增165 rDNA 的PCR 反应25-26
• 2.2.4.3 凝胶回收PCR 产物26
• 2.2.4.4 目的片段的连接26-27
• 2.2.4.5 感受态E.Coli 细胞的制备27-28
• 2.2.4.6 目的片段的转化28
• 2.2.4.7 阳性克隆的筛选和鉴定28-29
• 2.2.5 Bacillus. sp. bs-1 内切葡聚糖酶基因的克隆29-31
• 2.2.5.1 扩增内切葡聚糖酶基因的PCR 反应29
• 2.2.5.2 PCR 产物的凝胶回收29-30
• 2.2.5.3 目的片段的连接30
• 2.2.5.4 目的片段的转化30
• 2.2.5.5 阳性克隆的筛选和鉴定30-31
• 2.2.6 葡聚糖内切酶在大肠杆菌BL21（DE3）内的表达31-36
• 2.2.6.1 重组质粒的构建31-32
• 2.2.6.2 重组质粒的转化32
• 2.2.6.3 重组质粒的提取32-33
• 2.2.6.4 双酶切检测连接状况33
• 2.2.6.5 重组质粒（表达载体pET-30a-C）的转化33
• 2.2.6.6 IPTG 的诱导表达33-34
• 2.2.6.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）34-36
• 3 结果与分析36-48
• 3.1 甜高粱秸杆的预处理分析36-39
• 3.1.1 葡萄糖标准曲线的确定36
• 3.1.2 机械粉碎处理对酶降解的影响36-37
• 3.1.3 高温处理对酶降解的影响37
• 3.1.4 超声波处理对甜高粱秸秆酶解影响37-38
• 3.1.5 酸处理对甜高粱秸秆酶解影响38
• 3.1.6 碱处理对甜高粱秸秆酶解影响38-39
• 3.1.7 有机溶剂处理对甜高粱秸秆酶解影响39
• 3.2 细菌的筛选39-41
• 3.3 细菌的鉴定41-43
• 3.3.1 革兰氏染色鉴定41-42
• 3.3.2 16S rDNA 分子鉴定42
• 3.3.3 16S rDNA 序列的测定及分析42-43
• 3.4 内切葡聚糖酶的分子克隆43-45
• 3.4.1 内切葡聚糖酶基因的扩增43-45
• 3.4.2 带有内切葡聚糖酶基因的重组表达载体pET-30a(+)-C 的构建45
• 3.5 内切葡聚糖酶基因的表达45-48
• 3.5.1 内切葡聚糖酶氨基酸序列分析45-46
• 3.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）46-48
• 4 结论与讨论48-50
• 4.1 秸秆纤维素预处理48
• 4.2 降解纤维素菌株的筛选48
• 4.3 Bacillus.sp.bs-1 内切葡聚糖酶的克隆48-49
• 4.4 内切葡聚糖酶在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达49-50
• 致谢50-51
• 参考文献51-53
• 作者简介53

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