牛瘤胃中纤维素降解菌的分离鉴定及对玉米秸秆发酵效果的研究

【摘要】：农作物秸秆是一种潜在的非竞争性资源,具有数量大、分布广、种类多的特点。目前,在全球资源和粮食紧缺的今天,发展秸秆畜牧业具有重大的生态价值和经济价值。本研究以牛的瘤胃内容物作为微生物的来源,以期获得优良的纤维素酶高产菌株,来最大限度地开发和利用秸秆资源,解决人畜争粮问题,促进我国畜牧业的发展。本研究主要包括如下四部分内容: 试验一:经选择性培养基初筛、纤维素刚果红培养基鉴别和固体发酵培养复筛,筛选出一株的纤维素酶活相对较高,并且能提高玉米秸秆中还原糖和可溶性蛋白含量的菌株(No.3)。其羧甲基纤维素酶活和滤纸糖酶活分别达到6.01 U/g和1.15 U/g。经形态特征观察和26S rDNA ITS区序列分析确定其为米曲霉(Aspergillus oryzae)。 试验二:本研究将从牛瘤胃内容物中筛选出的纤维素酶高产菌株米曲霉用于玉米秸秆固态发酵,对其发酵效果及酶学特性进行分析。结果显示:该菌所产纤维素酶的最适pH为5.5～6.0,在4.0～6.0范围内稳定性较好;最适温度为50℃,在30℃～50℃区间稳定性较好。CaCl2和MnSO4对纤维素酶活表现出显著的促进作用。FeSO4和NaCl对纤维素酶活表现出强抑制作用。KH2PO4、MgSO4、ZnCl2、CoCl2对浓度范围要求严格,并且对不同纤维素酶活表现出的作用不同。与发酵前相比,发酵后的玉米秸秆中还原糖和可溶性蛋白含量分别提高123.53%和48.98%(P0.05);纤维素和半纤维素的降解率分别为25.01%和45.99%(P0.05)。这表明该菌株具有较高的应用价值,可以作为开发和利用农作物秸秆的优良菌株。 试验三:通过研究不同发酵条件对玉米秸秆发酵效果的影响,以确定米曲霉最适发酵条件。试验结果显示,以10%的复合饲料添加量(P0.05),1%接种量(P0.05),1:1.5的料水比(P0.05),粉碎粒度1~2 cm(P0.05),固体发酵3 d(P0.05)为最佳发酵条件。 试验四:为了研究日粮中添加米曲霉发酵玉米秸秆粉代替等量玉米对肉鸡营养物质代谢率、肠道微生物区系和消化酶的影响。本试验选择25只6周龄AA肉鸡,随机分成五组,正处理组设4%、8%和12%三个水平,用发酵秸秆代替基础日粮中等量玉米。用基础日粮(对照组)和8%未发酵秸秆替代基础日粮中等量玉米(负处理组)作对比。试验结果显示:添加一定量的发酵玉米秸秆粉有助于粗蛋白、粗脂肪、钙、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的消化吸收,但不利于磷的消化吸收。与负处理组和对照组相比,日粮中添加发酵玉米秸秆粉使回肠和盲肠中的乳酸菌和米曲霉的数量显著增加(P0.05),大肠杆菌数显著降低(P0.05);纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶活力显著提高(P0.05),其中以8%添加量为最佳。 【关键词】：牛瘤胃 米曲霉 纤维素酶 玉米秸秆发酵 纤维素降解 肉仔鸡
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S816
【目录】：

• 致谢4-11
• 内容摘要11-12
• Summary12-14
• 引言14-15
• 第一章 文献综述15-27
• 1.1 秸秆资源15-17
• 1.1.1 丰富的秸秆资源15
• 1.1.2 秸秆作为饲料的处理15-17
• 1.1.2.1 物理处理法16-17
• 1.1.2.2 化学处理法17
• 1.1.2.3 生物处理17
• 1.2 纤维素生物质17-20
• 1.2.1 秸秆中纤维素17-19
• 1.2.2 纤维素结构19-20
• 1.2.3 半纤维素结构20
• 1.2.4 木质素结构20
• 1.3 纤维素分解菌20-21
• 1.3.1 自然界纤维素分解菌20
• 1.3.2 瘤胃内纤维素分解菌20-21
• 1.3.2.1 瘤胃内细菌的作用20-21
• 1.3.2.2 瘤胃真菌的作用21
• 1.3.2.3 瘤胃原虫的作用21
• 1.4 纤维素酶21-24
• 1.4.1 纤维素酶的组成21-22
• 1.4.2 纤维素酶的结构与功能22
• 1.4.3 纤维素酶降解机制22-24
• 1.5 秸秆发酵饲料的研究及应用24-25
• 1.5.1 秸秆发酵饲料的研究24-25
• 1.5.2 微生物发酵秸秆在养殖业中的应用及效果25
• 1.5.2.1 发酵秸秆喂反刍动物25
• 1.5.2.2 发酵秸秆喂猪25
• 1.5.2.3 发酵秸秆喂鸡25
• 1.6 秸秆发酵饲料发展前景25-26
• 1.7 本研究的目的与意义26-27
• 第二章 牛瘤胃中纤维素降解真菌的分离及鉴定27-36
• 2.1 材料与方法27-30
• 2.1.1 材料27-28
• 2.1.1.1 样品来源27
• 2.1.1.2 仪器设备27
• 2.1.1.3 玉米秸秆27
• 2.1.1.4 选择性初筛固体培养基27
• 2.1.1.5 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)分离培养基27
• 2.1.1.6 纤维素刚果红鉴别培养基27
• 2.1.1.7 种子培养基27
• 2.1.1.8 固体发酵培养基27-28
• 2.1.1.9 种曲的培养和制备28
• 2.1.2 菌株筛选28
• 2.1.2.1 菌株初筛28
• 2.1.2.2 菌株纯化28
• 2.1.2.3 菌株鉴别28
• 2.1.2.4 固体发酵复筛28
• 2.1.3 菌株鉴定28
• 2.1.3.1 菌株的形态特征观察28
• 2.1.3.2 分子生物学鉴定28
• 2.1.4 酶活力的测定28-30
• 2.1.4.1 3，5-二硝基水杨酸显色剂28-29
• 2.1.4.2 pH 4.5，0.2 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液29
• 2.1.4.3 葡萄糖标准曲线的绘制29
• 2.1.4.4 粗酶液制备29
• 2.1.4.5 羧甲基纤维素酶活力的测定（CMCase）29-30
• 2.1.4.6 滤纸糖酶活力测定30
• 2.1.5 发酵秸秆中还原糖和可溶性蛋白的测定30
• 2.1.6 统计分析30
• 2.2 结果30-34
• 2.2.1 菌株初筛30
• 2.2.2 菌株复筛30-31
• 2.2.3 不同菌株对比31-32
• 2.2.4 菌株鉴定32-34
• 2.2.4.1 形态特征观察32
• 2.2.4.2 分子生物学鉴定32-34
• 2.3 讨论34-35
• 2.3.1 菌株的筛选34
• 2.3.2 菌株的鉴定34-35
• 2.4 结论35-36
• 第三章 米曲霉酶学特性分析及对玉米秸秆降解效果的研究36-50
• 3.1 材料与方法36-38
• 3.1.1 材料36
• 3.1.1.1 菌株36
• 3.1.1.2 仪器设备36
• 3.1.1.3 玉米秸秆36
• 3.1.1.4 种子培养基36
• 3.1.1.5 固体发酵培养基36
• 3.1.1.6 种曲的培养和制备36
• 3.1.2 酶活力的测定36
• 3.1.3 纤维素酶酶学特性的分析36-37
• 3.1.3.1 纤维素酶最适pH 的测定36
• 3.1.3.2 纤维素酶pH 稳定性的测定36
• 3.1.3.3 纤维素酶最适温度的测定36-37
• 3.1.3.4 纤维素酶热稳定性的测定37
• 3.1.3.5 无机盐对纤维素酶活性的影响37
• 3.1.4 遗传稳定性37
• 3.1.5 发酵玉米秸秆中各指标的测定37-38
• 3.1.5.1 固体发酵过程中pH 值的测定37
• 3.1.5.2 发酵秸秆中还原糖的测定37
• 3.1.5.3 发酵秸秆中可溶性蛋白的测定37
• 3.1.5.4 中性洗涤纤维（NDF）37
• 3.1.5.5 酸性洗涤纤维(ADF)37
• 3.1.5.6 酸性洗涤木质素(ADL)37-38
• 3.1.6 统计分析38
• 3.2 结果与分析38-47
• 3.2.1 纤维素酶的最适pH 值的测定38
• 3.2.2 纤维素酶pH 稳定性的测定38
• 3.2.3 纤维素酶的最适温度的测定38-39
• 3.2.4 纤维素酶温度稳定性的测定39-40
• 3.2.5 无机盐对纤维素酶活性的影响40-44
• 3.2.5.1 磷酸二氢钾对纤维素酶活性的影响40
• 3.2.5.2 硫酸镁对纤维素酶活性的影响40
• 3.2.5.3 氯化钙对纤维素酶活性的影响40-42
• 3.2.5.4 氯化钠对纤维素酶活性的影响42
• 3.2.5.5 硫酸亚铁对纤维素酶活性的影响42
• 3.2.5.6 硫酸锰对纤维素酶活性的影响42-44
• 3.2.5.7 氯化锌对纤维素酶活性的影响44
• 3.2.5.8 氯化钴对纤维素酶活性的影响44
• 3.2.6 遗传稳定性44-46
• 3.2.7 发酵过程中pH 值的变化46
• 3.2.8 发酵过程中玉米秸秆各成分的变化46-47
• 3.3 讨论47-48
• 3.3.1 pH 对纤维素酶活力和稳定性的影响47
• 3.3.2 温度对纤维素酶活力和稳定性的影响47
• 3.3.3 无机盐对纤维素酶活的影响47-48
• 3.3.4 发酵效果分析48
• 3.4 结论48-50
• 第四章 米曲霉发酵条件的初步研究50-56
• 4.1 材料与方法50
• 4.1.1 材料50
• 4.1.1.1 菌株50
• 4.1.1.2 种子培养基50
• 4.1.1.3 固体发酵培养基50
• 4.1.1.4 种曲的培养和制备50
• 4.1.2 试验设计50
• 4.1.3 酶活力的测定50
• 4.1.4 发酵玉米秸秆中还原糖和可溶性蛋白的测定50
• 4.1.4.1 发酵秸秆中还原糖的测定50
• 4.1.4.2 发酵秸秆中可溶性蛋白的测定50
• 4.1.5 统计分析50
• 4.2 结果与分析50-53
• 4.2.1 不同复合饲料添加量对发酵的影响50-51
• 4.2.2 不同发酵时间对发酵的影响51-52
• 4.2.3 不同接种量对发酵的影响52
• 4.2.4 不同粉碎粒度对玉米秸秆发酵效果的影响52
• 4.2.5 不同料水比对玉米秸秆发酵效果的影响52-53
• 4.3 讨论53-54
• 4.3.1 复合饲料对发酵的影响53
• 4.3.2 发酵时间对发酵的影响53-54
• 4.3.3 接种量对发酵的影响54
• 4.3.4 粉碎粒度对发酵的影响54
• 4.3.5 料水比对发酵的影响54
• 4.4 结论54-56
• 第五章 日粮中添加发酵玉米秸秆粉对肉鸡营养物质代谢率、肠道微生物区系及消化酶的影响56-64
• 5.1 材料与方法56-58
• 5.1.1 材料56
• 5.1.1.1 菌株56
• 5.1.1.2 试验动物56
• 5.1.1.3 玉米秸秆粉56
• 5.1.1.4 种子培养基56
• 5.1.1.5 玉米秸秆粉固体发酵培养基56
• 5.1.2 试验分组56
• 5.1.3 代谢试验设计56-57
• 5.1.4 测定指标及方法57-58
• 5.1.4.1 营养物质代谢率的测定57-58
• 5.1.4.2 肠道菌群数量58
• 5.1.4.3 肠道消化酶58
• 5.1.5 统计分析58
• 5.2 结果与分析58-61
• 5.2.1 发酵前后玉米秸秆中主要成分的变化58-59
• 5.2.2 饲料中添加米曲霉发酵玉米秸秆粉对肉鸡营养物质代谢率的影响59
• 5.2.3 饲料中添加米曲霉发酵玉米秸秆粉对肉鸡肠道微生物数量的影响59
• 5.2.4 饲料中添加米曲霉发酵玉米秸秆粉对肉鸡肠道消化酶活力的影响59-61
• 5.3 讨论61-63
• 5.3.1 发酵前后玉米秸秆中主要成分的变化61
• 5.3.2 饲料中添加米曲霉发酵玉米秸秆粉对肉鸡营养物质代谢率的影响61-62
• 5.3.3 饲料中添加米曲霉发酵玉米秸秆粉对肉鸡肠道微生物数量的影响62
• 5.3.4 饲料中添加米曲霉发酵玉米秸秆粉对肉鸡肠道消化酶的影响62-63
• 5.4 结论63-64
• 参考文献64-68

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