秸秆还田土壤中高效纤维素分解菌的筛选、鉴定及其生物效应研究

【摘要】：中国是农业大国,年产各种农作物秸秆约8.0亿t,占世界秸秆总产量的20%～30%,其中绝大部分作为废弃物被丢弃焚烧,不仅浪费了资源,也造成了严重的环境问题。秸秆还田是当今世界上普遍关注的一项培肥地力和增产增效的农艺措施,但还田玉米秸秆存在腐解难的问题,如何加速还田玉米秸秆的腐解是目前研究的热点。本研究采用纤维素-刚果红染色法从河北省山前平原小麦-玉米轮作区且长期秸秆还田的小麦季农田土壤中分离筛选出高效分解纤维素的菌株,在优化其产酶条件、发酵条件和CMC酶活力的基础上,进行了该菌株对玉米秸秆的腐解能力、土壤中固定态磷的释放和小麦生长及其磷营养状况的影响等方面研究。主要研究结果如下: 1.采用纤维素-刚果红染色法,经形态鉴定初步筛选出具有纤维素分解菌真菌8株,细菌20株;进一步采用水解圈测定,酶活力比较分析,得到高效纤维素分解真菌1株,编号为HB1,经18S rDNA基因序列分析,确定为草酸青霉(Penicillium oxalicum),命名为草酸青霉HB1(P. oxalicum HB1),该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC NO. 4842;得到高效纤维素分解细菌3株,编号为B1,B2和B3,其中B1、B2为芽孢杆菌,B3为无芽孢杆菌;室内摇瓶试验研究了草酸青霉HB1和3株细菌的生长曲线,并对内切葡聚糖酶(CMC酶)和滤纸酶(FPA酶)活力进行了测定。结果表明,利用CMC-Na培养基,按1%接种量,30℃,180rpm摇瓶培养72h,草酸青霉HB1菌株的CMC酶和FPA酶活力分别达672.8U和774.6U。培养12h时,B1和B3菌CMC酶活力近峰值,分别为31.2U和24.4U;培养18h时,B2菌CMC酶活力达最高,为36.3U。培养12h时,B1菌FPA酶活力达高峰,为34.1U;培养8h时,B2、B3菌FPA酶活力最大,分别为39.2U和163.6U。综合比较发现草酸青霉HB1菌株的CMC酶和FPA酶活力最高,因此对该菌株展开如下系统的研究。 2.草酸青霉HB1菌株发酵条件的优化 首先选择氮源、接种量、培养温度、发酵时间、培养基初始pH进行单因子试验,对草酸青霉产酶条件的影响,结果表明该菌最佳产酶条件为3%的牛肉膏蛋白胨为氮源,接种量为5%,培养温度为28℃～35℃,pH=4.0～7.0,培养48h～72h。进一步采用正交设计研究了pH、温度、固液比和培养时间四因素对草酸青霉HB1菌株发酵的影响,综合考虑CMC酶、FPA酶、纤维素酶、半纤维素酶四种酶活力,该菌株最优发酵条件为固液比为1:10,培养时间为48h,培养温度为30℃,pH为6.5。 在草酸青霉HB1菌株作为纤维素分解菌,以CMC-Na液体培养作基质,研究CMC酶活力的结果表明,该酶反应的最适pH为5.0左右,其pH的稳定性在4.0～5.0范围内,酶反应的最适温度为50℃,其热稳定性在40℃～50℃之间。 3.草酸青霉HB1对玉米秸秆腐解能力评价 采用室内摇瓶试验、土样培养试验及小麦盆栽试验对其进行了系统研究。利用玉米秸秆替代CMC-Na的培养基中,按1%接种量,30℃,180rpm摇瓶培养72h,CMC酶和FPA酶活力则分别为282.9U,618.3U,纤维素酶活力为376.1U;利用3%的牛肉膏蛋白胨为氮源,接种量为5%,培养温度为30℃,pH=7.0,培养72h,其CMC酶活力高达888.8U。从腐解秸秆的形态特征发现,草酸青霉HB1处理的秸秆与对照相比形态发生明显改变,在培养10d后,秸秆腐解率达87.3%,为对照的1.90倍;初步说明该菌株具有较强的玉米秸秆腐解能力。在土壤培养试验中,培养30d时,接种草酸青霉HB1的土壤中玉米秸秆的腐解率达83.5%,是对照的1.62倍;在小麦盆栽试验中,培养50d时,接种草酸青霉HB1的土壤中还田秸秆腐解率达70.8%,高于对照15.1%。 4.土壤中接种草酸青霉HB1的解磷作用及其生物效应研究土壤培养试验以及小麦盆栽试验研究还表明,接种草酸青霉HB1有利于土壤固定态磷的释放和提高植物对磷的吸收利用。在土壤培养30d时,处理组和对照组中土壤速效磷含量分别达98.6mg/kg和77.1mg/kg,高出对照27.9%;在培养50d时,小麦植株地上部和地下部,处理组和对照组全磷含量分别为12.6g/kg、7.62g/kg和25.9g/kg、21.1g/kg,分别高出对照65.3%和22.7%,差异显著性分析表明,各处理组与其对照组差异显著;同时有利于植物的生长,在培养30d时,小麦植株生物量增加16.8%。 本试验所获得的草酸青霉HB1对玉米秸秆腐解的同时在土壤中解磷的特性还未见其他作者报道,具有进一步利用研究的价值。 【关键词】：秸秆还田土壤 纤维素分解菌 酶活力 玉米秸秆腐解 生物效应
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：S141.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 引言11-19
• 1.1 研究背景及意义11
• 1.2 国内外研究进展11-17
• 1.2.1 秸秆还田的研究进展11-12
• 1.2.2 纤维素和纤维素酶的研究进展12-15
• 1.2.3 纤维素分解菌的研究进展15-16
• 1.2.4 微生物产酶条件的研究进展16-17
• 1.2.5 纤维素酶活力的研究进展17
• 1.3 研究内容17-19
• 2 秸秆还田土壤中高效纤维素分解菌的筛选及其特性研究19-32
• 2.1 材料与方法19-20
• 2.1.1 土壤样品19
• 2.1.2 培养基19
• 2.1.3 主要试剂19-20
• 2.1.4 主要仪器设备20
• 2.2 方法20-23
• 2.2.1 纤维素分解菌的分离20
• 2.2.2 高效菌株的筛选20-21
• 2.2.3 高效菌株的鉴定21-22
• 2.2.4 高效菌株生长曲线的测定22
• 2.2.5 CMC 酶和FPA 酶活力的测定22-23
• 2.2.6 数据分析23
• 2.3 结果与分析23-30
• 2.3.1 纤维素菌的分离及其基本形态观察23-24
• 2.3.2 高效菌株的筛选24-26
• 2.3.3 高效纤维素菌株培养性状的显微观察及其鉴定26-27
• 2.3.4 生长曲线的测定27-28
• 2.3.5 高效菌株CMC 酶和FPA 酶活力测定28-30
• 2.4 讨论30-31
• 2.5 小结31-32
• 3 草酸青霉HB1 菌株发酵条件的优化32-44
• 3.1 材料与方法32-34
• 3.1.1 酶活的测定32
• 3.1.2 草酸青霉HB1 菌株产酶条件的优化32-33
• 3.1.3 草酸青霉HB1 菌株发酵条件的优化33
• 3.1.4 草酸青霉HB1 菌株 CMC 酶活力的研究33
• 3.1.5 数据分析33-34
• 3.2 结果与分析34-43
• 3.2.1 草酸青霉HB1 菌株产酶条件的优化34-36
• 3.2.2 草酸青霉HB1 菌株发酵条件的优化36-41
• 3.2.3 草酸青霉HB1 菌株 CMC 酶活力的研究41-43
• 3.3 讨论43
• 3.4 小结43-44
• 4 草酸青霉HB1 对玉米秸秆腐解能力的评价44-47
• 4.1 材料与方法44-45
• 4.1.1 草酸青霉HB1 产CMC 酶、FPA 酶和纤维素酶活力测定44
• 4.1.2 秸秆摇瓶试验44
• 4.1.3 土壤培养试验44
• 4.1.4 小麦盆栽试验44
• 4.1.5 数据分析44-45
• 4.2 结果与分析45-46
• 4.2.1 草酸青霉HB1 产CMC 酶、FPA 酶和纤维素酶活力测定45
• 4.2.2 秸秆摇瓶试验45
• 4.2.3 土壤培养试验45
• 4.2.4 小麦盆栽试验45-46
• 4.3 讨论46
• 4.4 小结46-47
• 5 草酸青霉HB1 的生物效应研究47-55
• 5.1 材料与方法47-48
• 5.1.1 菌株活化47
• 5.1.2 发酵液的制备47
• 5.1.3 草酸青霉HB1 对小麦种子发芽率及出苗情况的影响47
• 5.1.4 草酸青霉HB1 解磷能力的研究47-48
• 5.1.5 数据分析48
• 5.2 结果与分析48-53
• 5.2.1 草酸青霉HB1 对小麦种子发芽率及出苗情况的影响48
• 5.2.2 草酸青霉菌HB1 对小麦全磷含量的影响48-49
• 5.2.3 青霉菌HB1 对小麦植株生长的影响49-50
• 5.2.4 草酸青霉菌HB1 对土壤速效磷的影响50-51
• 5.2.5 3 株细菌对小麦、玉米种子发芽率及出苗情况的影响51-52
• 5.2.6 3 株细菌生物化学效应研究52-53
• 5.3 讨论53-54
• 5.4 小结54-55
• 6 结论与展望55-57
• 6.1 结论55-56
• 6.2 展望56-57
• 参考文献57-63
• 在读期间发表的学术论文63
• 在读期间申请的专利63-64
• 作者简介64-65
• 致谢65-66

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