甜高粱秸秆制取燃料乙醇发酵菌种的选育研究

【摘要】：甜高粱为短日照C4植物,光合效率是C3作物的2~8倍,具有耐干旱、耐水涝、抗盐碱等多重抗逆性及生物产量高,糖分积累快等特点。利用甜高粱发酵生产燃料乙醇,将会成为解决未来能源问题的一条有效途径。 本论文对甜高粱秸秆固态发酵六碳糖的菌种选育及其发酵工艺做了研究;并利用发酵后的甜高粱秸秆作为原料制备饲料,为发酵后产物的再利用奠定技术基础;发酵后的甜高粱秸秆纤维素水解产物木糖的发酵菌种选育是一个世界性难题,针对这个难题,本文克隆了木糖代谢途径中的五个关键酶基因,并对转醛酶进行了活性表达。具体内容如下: 1)以耐酒精高活性干酵母为原始出发菌株做~(60)Co-γ辐射处理,经多级筛选获得诱变优势菌株H12、H13、H15,再经甜高粱秸秆固态发酵实验,确定H13为最佳诱变菌株。 2)研究了最佳诱变菌株H13对甜高粱秸秆固态发酵工艺,得到的最适工艺条件是:粉碎后的甜高粱秸秆300g,5‰的菌体接种量、68%的基质含水量、36℃条件下发酵60h;经测定,乙醇产率达6.4g/100g鲜秸秆,发酵后基质的还原糖含量为0.31%。 3)利用发酵后的甜高粱秸秆为原料,采用不同的霉菌分别与酵母H13组合进行发酵,从而确定康宁木霉与酵母H13的组合为最佳发酵菌种组合,并对其发酵条件进行优化。结果表明:每份150g秸秆发酵培养基中辅以15%豆饼粉、2%硫酸铵,含水量为60%,以12%的接种量接入混合菌液(1:1的混合比例),32℃培养4d,可使发酵饲料中的粗蛋白含量由16.5%提高到21.7%,提高率为31.5%,粗纤维由15.8%降低到12.5%,降幅为20.9%。 4)从树干毕赤酵母和酿酒酵母中提取总RNA,通过RT-PCR克隆得到XYL1、XYL2、XKS1、TAL1、TKL1,分别与pGM-T载体连接,转化感受态DH5α,获得转化重组子,测序结果显示,克隆得到的五个基因序列与基因库中所公布的序列同源性达99%以上,其中TAL1的序列同源性为99.90%,氨基酸同源性为100%。 5)构建pAUR123-TAL1重组质粒,经测序,其序列与pGM-TAL1的序列完全一致。通过电击转化酿酒酵母,并实现了TAL1在酿酒酵母中的活性表达。 【关键词】：甜高粱秸秆 诱变育种 固态发酵 蛋白饲料 转醛酶基因
【学位授予单位】：汕头大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S216.2
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 缩略词6-10
• 第一章 绪论10-24
• 1.1 燃料乙醇的发展现状及其研究意义10-12
• 1.1.1 燃料乙醇10
• 1.1.2 国内外燃料乙醇产业的发展现状10-11
• 1.1.3 燃料乙醇的研究意义11-12
• 1.2 甜高粱及其制取燃料乙醇产业的发展现状12-15
• 1.2.1 甜高粱作为燃料乙醇原料的优势12-14
• 1.2.2 国内外甜高粱燃料乙醇产业发展现状14-15
• 1.3 菌种的诱变选育15-16
• 1.4 甜高粱秸秆发酵生产燃料乙醇16-17
• 1.5 微生物发酵秸秆饲料的研究17-19
• 1.5.1 微生物发酵秸秆饲料的原理17
• 1.5.2 微生物发酵秸秆饲料的菌种17-18
• 1.5.3 微生物发酵秸秆饲料对原料的要求18-19
• 1.6 木糖代谢途径在酿酒酵母中的构建19-22
• 1.6.1 木糖在微生物中的代谢途径19-20
• 1.6.2 木糖代谢途径的引入20-22
• 1.7 本文研究目的意义及内容22-24
• 1.7.1 研究目的意义22
• 1.7.2 研究内容22-24
• 第二章 甜高粱秸秆发酵菌株的诱变选育24-34
• 2.1 材料和方法24-27
• 2.1.1 实验材料24-25
• 2.1.2 实验仪器25
• 2.1.3 实验方法25-27
• 2.2 结果与分析27-33
• 2.2.1 总糖、还原糖和乙醇含量测定标准曲线图27-28
• 2.2.3 TTC平板一级筛选结果28-29
• 2.2.4 杜氏小管二级筛选结果29-31
• 2.2.5 液态摇瓶发酵三级筛选结果31-32
• 2.2.6 甜高粱秸秆固态发酵最佳菌种确定32-33
• 2.3 讨论33-34
• 第三章 诱变株H13 最佳发酵条件的确定34-39
• 3.1 材料和方法34-35
• 3.1.1 实验材料34
• 3.1.2 实验仪器34-35
• 3.1.3 实验方法35
• 3.2 结果与分析35-38
• 3.2.1 接种量对甜高粱秸秆固态发酵的影响35-36
• 3.2.2 温度对甜高粱秸秆固态发酵的影响36
• 3.2.3 含水量对甜高粱秸秆固态发酵的影响36-37
• 3.2.4 时间对甜高粱秸秆固态发酵的影响37-38
• 3.3 讨论38-39
• 第四章 发酵后甜高粱秸秆制备饲料的研究39-46
• 4.1 材料和方法39-41
• 4.1.1 实验材料39-40
• 4.1.2 实验仪器40
• 4.1.3 实验方法40-41
• 4.2 结果与分析41-45
• 4.2.1 最佳发酵菌种组合的确定41-42
• 4.2.2 接种量对饲料发酵的影响42
• 4.2.3 基质含水量对饲料发酵的影响42-43
• 4.2.4 硫酸铵的添加量对饲料发酵的影响43
• 4.2.5 温度对饲料发酵的影响43-44
• 4.2.6 时间对饲料发酵的影响44-45
• 4.3 讨论45-46
• 第五章 木糖代谢途径相关基因的克隆与序列分析46-57
• 5.1 材料与方法46-49
• 5.1.1 实验材料46-47
• 5.1.2 实验仪器47
• 5.1.3 实验方法47-49
• 5.2 结果与分析49-56
• 5.2.1 Total RNA的提取49-51
• 5.2.2 PCR扩增结果51-53
• 5.2.3 DNA与pGM-T载体的连接53-55
• 5.2.4 pGM-TAL1 转化重组子的筛选鉴定55-56
• 5.2.5 克隆基因序列分析56
• 5.3 讨论56-57
• 第六章 转醛酶基因在酿酒酵母中的表达57-68
• 6.1 材料与方法57-61
• 6.1.1 实验材料57-58
• 6.1.2 实验仪器58
• 6.1.3 实验方法58-61
• 6.2 结果与分析61-67
• 6.2.1 TAL基因的扩增61-62
• 6.2.2 TAL基因与表达载体pAUR123 连接62-63
• 6.2.3 pAUR123-TAL1 转化重组子的筛选与鉴定63-65
• 6.2.4 酿酒酵母转化重组子的筛选与鉴定65-66
• 6.2.5 酿酒酵母转化重组子的表达与活性测定66-67
• 6.3 讨论67-68
• 总结与展望68-69
• 参考文献69-74
• 致谢74-75
• 硕士期间发表论文情况75

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