用于蘑菇养殖的秸秆堆肥中高温纤维素降解菌的筛选鉴定及相关水解酶的研究

【摘要】：木质纤维素物质是地球上最丰富的可再生资源,利用微生物对其进行降解,转化为可被人类利用的有效能源,对解决日益严重的能源危机具有极其重要的意义。堆肥是木质纤维素被活跃降解的生境之一,本文从聊城莘县朝城镇堆制的用于蘑菇培养的高温秸秆堆肥中筛选获得具有明显羧甲基纤维素(CMC)水解圈的菌株,并对其进行相关性质研究,主要的工作内容和结果如下： 1、秸秆堆肥中高温纤维素降解菌筛选鉴定。 近年来不断有纤维素降解微生物得到分离和研究,但只有少数微生物产生的纤维素酶系能够完全水解纤维素,并用于工业化使用。本文通过CMC平板活性筛选,从聊城莘县朝城镇堆置的秸秆堆肥中筛选获得了9株具有明显CMC水解圈的菌株,其中B6、B60-1和B60-3从一次发酵堆肥中获得,属于链霉菌属,产木聚糖酶；D1、D2.1、D2.2、D2.3和D3从二次发酵堆肥中获得,为链霉菌属,具有CMCase活性；菌株E1虽然具有较明显的CMC水解圈,但没有检测到胞外酶活和菌体酶活,为芽孢杆菌属,基因组含有GH48纤维素外切酶基因。 2、堆肥木质纤维素成分分析及二次发酵堆肥中放线菌多样性研究。 通过分析堆肥各阶段样品的木质纤维素成分的分析发现在堆肥过程中秸秆的木质素相对含量有所上升,这是由于其降解速率远远小于纤维素和半纤维素而导致的累积效果；纤维素在一次发酵初期有明显降解,由40%下降到25%；半纤维素在堆肥过程中一直保持持续缓慢的降解。对二次发酵堆肥样品的放线菌多样性研究发现,其中的菌种多为未培养微生物,还不能明确其分类地位和作用。 3、筛选菌株粗酶液性质研究。 从二次发酵堆肥中筛选得到5株具有CMCase活性的菌株,其粗酶液表现相似的酶学性质：最适酶反应温度50-65℃,最适酶反应pH5.0。从一次发酵堆肥中筛选的3株菌,具有木聚糖酶活性,最适酶反应温度为70℃,在60℃孵育10h仍能保持60%以上的酶活力,最适酶反应pH较为广泛6.0-9.0,并表现较好的耐受性。对菌株B6的发酵进程测定,发现其可在较短时间内达到最大产酶量。同时,B6在以2%秸秆和0.5%peptone为碳氮源培养其产酶量较初始CMC发酵培养基培养时得到很大提高(10倍),为酶的大量获得提供了可能。 4、菌株B6产木聚糖酶的分离纯化及质谱鉴定。 对菌株B6的粗酶液经DEAE柱层析分离,SDS-PAGE复性电泳刚果红染色,菌株B6产分子量约为45kDa的木聚糖酶,该蛋白对不溶性木聚糖具有吸附结合能力,质谱鉴定未检索成功,推测其可能是未报道的蛋白。 5、菌株B6木聚糖酶基因扩增。 通过GH10\GH11木聚糖酶通用兼并引物扩增的到与链霉菌来源的木聚糖酶具有较高相似性的木聚糖酶基因片段,为进一步了解B6产木聚糖酶提供了可能。 【关键词】：堆肥 纤维素降解菌 木聚糖酶 蛋白纯化
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：S646;S182
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略表11-12
• 第一章 绪论12-24
• 1.1 木质纤维素的结构12-15
• 1.1.1 纤维素结构12-14
• 1.1.2 半纤维素结构14
• 1.1.3 木质素结构14-15
• 1.2 木质纤维素降解微生物15-18
• 1.2.1 纤维素降解微生物15-16
• 1.2.2 半纤维降解微生物16-17
• 1.2.3 木质素降解微生物17-18
• 1.3 木质纤维素降解酶18-22
• 1.3.1 纤维素酶18-20
• 1.3.2 半纤维素酶20-21
• 1.3.3 木质素降解酶21-22
• 1.4 立题依据和工作思路22-24
• 第二章 高温纤维素降解菌的筛选鉴定24-42
• 2.1 实验材料24-25
• 2.1.1 样品来源24
• 2.1.2 培养基和试剂24-25
• 2.1.3 主要仪器25
• 2.2 实验方法25-27
• 2.2.1 菌种筛选25
• 2.2.2 酶活检测25-26
• 2.2.3 菌种初步鉴定26-27
• 2.3 结果与分析27-40
• 2.3.1 纤维素降解菌的筛选27-29
• 2.3.2 酶活检测29-30
• 2.3.3 菌种鉴定30-40
• 2.4 讨论40-42
• 第三章 秸秆堆肥木质纤维素成分分析及其微生物多样性分析42-52
• 3.1 材料与仪器42-43
• 3.1.1 样品采集42
• 3.1.2 主要试剂42-43
• 3.1.3 主要仪器43
• 3.2 实验方法43-46
• 3.2.1 木质纤维素成分测定43-45
• 3.2.2 微生物多样性分析45-46
• 3.3 结果与分析46-51
• 3.3.1 堆肥各阶段样品木质纤维素成分分析46-47
• 3.3.2 一次发酵秸秆堆肥不同深度样品木质纤维素成分分析47
• 3.3.3 二次发酵堆肥样品放线菌多样性分析47-51
• 3.4 讨论51-52
• 第四章 产纤维素酶分离菌粗酶液性质分析及发酵条件初步优化52-62
• 4.1 实验材料52-53
• 4.1.1 菌种52
• 4.1.2 培养基和试剂52
• 4.1.3 主要仪器52-53
• 4.2 实验方法53-55
• 4.2.1 粗酶液制备53
• 4.2.2 酶活检测方法53-54
• 4.2.3 发酵进程测定54
• 4.2.4 蛋白含量分析54
• 4.2.5 碳源对酶产量的影响54
• 4.2.6 氮源对酶产量的影响54-55
• 4.3 结果与分析55-60
• 4.3.1 酶反应最适温度及温度稳定性的测定55-57
• 4.3.2 酶反应最适pH及pH稳定性的测定57-58
• 4.3.3 发酵进程酶活分析58-60
• 4.3.4 发酵培养基对酶产量的影响60
• 4.4 讨论60-62
• 第五章 B6菌株产木聚糖酶蛋白纯化及其基因克隆的研究62-83
• 5.1 材料与方法62-71
• 5.1.1 菌种及培养基62-63
• 5.1.2 引物63
• 5.1.3 主要试剂与仪器63-64
• 5.1.4 酶的分离纯化64
• 5.1.5 不溶性木聚糖、Avicel吸附研究64-65
• 5.1.6 质谱鉴定65
• 5.1.7 木聚糖酶基因扩增65-67
• 5.1.8 菌株B6基因组文库构建67-70
• 5.1.9 其他分析方法70-71
• 5.2 结果与分析71-82
• 5.2.1 木聚糖酶的离子交换层析分离71-73
• 5.2.2 木聚糖酶对不溶性木聚糖、Avicel的吸附研究73-74
• 5.2.3 质谱鉴定74-76
• 5.2.4 木聚糖酶基因扩增76-80
• 5.2.5 B6基因组文库构建及筛选80-82
• 5.3 讨论82-83
• 全文总结83-85
• 参考文献85-89
• 致谢89-91
• 学位论文评阅及答辩情况表91

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