RNA干涉ZmCoA基因对玉米秸秆木质素含量及组分影响的研究

【摘要】：玉米(ZeaMaysL.)秸秆的主要成分是木质素和纤维素。木质素主要沉积在维管植物的细胞壁中，有增强机械耐受强度和疏导水分的作用。由于木质素结构较复杂，在生产中很难被有效利用，对牧草质量、纸张制造及生物燃料生产具有负面效应。因此利用基因工程手段，在分子水平上调节木质素的生物合成，在不影响植物正常生长的前提下，降低木质素的含量或改变其组分具有重要的意义。该文以玉米B73为植物材料，利用RNAi技术，围绕木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)的基因，构建干涉表达载体，开展农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化，并对转化植株进行筛选，同时对转CoA基因的植株进行分子检测和木质素含量检测，取得如下主要结果： 1、采用改良的CTAB法提取玉米B73的基因组DNA，利用PCR技术克隆得到COMT基因和CoA基因的部分序列，以pUCCRNAi与p1301载体作为中间载体，通过基因工程成功构建含CaMV35S组成型启动子和抗除草剂Bar基因的RNA干涉载体p1301+COA(±)+Bar与p1301+COMT(±)+Bar。 2、建立玉米茎尖转化体系，将p1301+COA(±)+Bar干涉表达载体导入玉米自交系郑58中，获得了抗除草剂的含RNA干涉表达载体的转基因植株。 3、对T1代PCR检测阳性转基因植株进行RT-PCR分析和秸秆进行Klason木质素及纤维素的测定，结果显示：RNAi降低了ZmCoA基因的表达水平,转基因植株Klason木质素含量与对照相比平均降低了22.44%，纤维素含量与对照相比平均增加了23.33%。 4、将转基因株系茎秆冷冻切片分别在100×和200×下观察，发现转基因植株维管鞘的颜色要比野生型的浅，证明抑制内源ZmCoA基因降低了木质素在维管束部位的沉积，是转基因玉米中木质素含量降低的结果。 5、通过GC-MS对木质素单体的相对含量进行测定，得到野生型植株中的S/G为0.636，转基因植株中的S/G为0.999，S/G升高，即S-木质素与G-木质素的含量比值增加，有利于木质素的去除。 综上所述，本文成功构建了RNA干涉表达载体p1301+COA(±)+Bar与p1301+COMT(±)+Bar，并将p1301+COA(±)+Bar进行玉米遗传转化，获得转基因植株；对含干涉表达载体的转基因玉米植株进行了系统的检测，转基因玉米中不仅降低了木质素的含量，而且改变了木质素的构成，本研究将对培育低木质素玉米和深入了解木质素合成机制奠定基础。 【关键词】：玉米 RNAi CCoAOMT 木质素 纤维素 组织化学染色
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 1 文献综述8-21
• 1.1 木质素的组成及分布9-11
• 1.1.1 木质素的组成9-10
• 1.1.2 木质素的分布10-11
• 1.2 木质素的生物合成途径11-12
• 1.3 玉米中的木质素调控相关研究12-13
• 1.4 木质素生物合成途径中的关键酶13-17
• 1.4.1 苯丙氨酸解氨酶 (PAL)13-14
• 1.4.2 香豆酸辅酶 A 连接酶 (4CL)14
• 1.4.3 肉桂酸 4 -经基化酶 (C4H)14
• 1.4.4 咖啡酸- O-甲基转移酶 (COMT) 和阿魏酸 5 -羟基化酶(F5H)14-15
• 1.4.5 香豆酸3-羟基化酶 (C3H)15
• 1.4.6 咖啡酰辅酶 A 甲基转移酶 (CCoAOMT)15-16
• 1.4.7 芥子醇脱氢酶 (SAD) 与肉桂醇脱氢酶 (CAD)16
• 1.4.8 肉桂醛辅酶 A 还原酶 (CCR)16-17
• 1.5 木质素生物合成调控研究进展17-19
• 1.5.1 木质素总量合成的生物调控17-18
• 1.5.2 木质素单体特异性合成关键酶的调控18-19
• 1.6 木质素合成调控的转基因技术发展19-21
• 2 引言21-22
• 3 材料与方法22-42
• 3.1 材料22-23
• 3.1.1 实验材料22
• 3.1.2 主要试剂及培养基配制22-23
• 3.1.3 引物设计23
• 3.2 仪器设备23-24
• 3.3 研究方法24-42
• 3.3.1 目的基因片段的获得24-28
• 3.3.2 pUCCRNAi＋2F 载体的构建28-31
• 3.3.3 p1301＋Bar+2F 载体的构建31-33
• 3.3.4 p1301＋Bar+2F 干涉表达载体转化农杆菌33-34
• 3.3.5 玉米的茎尖转化34-36
• 3.3.6 转基因植株的分子检测36-37
• 3.3.7 Klason 木质素、纤维素含量的测定37-40
• 3.3.8 组织化学染色40-41
• 3.3.9 利用 GC - MS 分析木质素单体的组分变化41-42
• 4 结果与分析42-50
• 4.1 目的基因片段的获得42
• 4.2 载体构建验证42-45
• 4.2.1 pUCCRNAi+2F 载体构建验证42-44
• 4.2.2 p1301＋Bar+2F 表达载体构建验证44-45
• 4.3 干涉载体导入农杆菌的验证及转基因植株的获得45-46
• 4.3.1 干涉载体的 PCR 验证45-46
• 4.3.2 转基因植株的获得46
• 4.4 转 CCoAOMT 基因植株的检测46-50
• 4.4.1 转 CCoAOMT 基因植株的 PCR 检测46-47
• 4.4.2 转基因植株的半定量 RT-PCR 检测47
• 4.4.3 转基因植株的 Klason 木质素与纤维素的测定47-48
• 4.4.4 转基因植株的组织化学染色观察48-49
• 4.4.5 GC - MS 分析木质素单体组分的改变49-50
• 5 讨论50-52
• 5.1 CCoAOMT 基因的下调对玉米木质素的含量及组分有影响50-51
• 5.2 抑制 CCoAOMT 表达对植株正常生长的影响51-52
• 6 结论52-53
• 参考文献53-61
• 致谢61-62
• 作者简介62

您可以在本站搜索以下学术论文文献来了解更多相关内容

杉木综纤维素和木质素的近红外光谱法测定    黄安民;江泽慧;李改云;

四川2种丛生竹理化特性及纤维形态研究    胡尚连;蒋瑶;陈其兵;曹颖;孙霞;卢学琴;

竹子木质素合成酶基因克隆与分析    何聪芬;刘蕾;董银卯;张淑萍;庄彩云;姚娜;李潞滨;

长江流域植物和土壤的木质素特征    于灏;吴莹;张经;姚庆祯;朱卓毅;

近红外光谱法快速测定毛竹Klason木质素的含量    李改云;黄安民;王戈;覃道春;江泽慧;

漆酶/木聚糖酶体系直接降解木质素的研究    尤纪雪;陈星星;李雨楠;叶汉玲;

抑制CCoAOMT表达的转基因杨树的制浆性能    魏建华;王彦珍;王宏芝;李瑞芬;林楠;马荣才;曲乐庆;宋艳茹;

从源头防治制浆造纸废水污染的新策略    宋艳茹,马庆虎,卢善发

四川2种丛生竹木质素和纤维含量的研究    贾举庆;胡尚连;孙霞;曹颖;

近红外反射光谱法测定苜蓿干草主要纤维成分的研究    聂志东;韩建国;玉柱;仲勇;刘富渊;

牛精子总RNA制备及mRNA线性扩增的初步研究    岳洋;朱化彬;郝海生;杜卫华;赵学明;王栋;

冷诱导RNA结合蛋白的结构与功能    李士泽;赵雅楠;李玉恒;杨焕民;

HC-Pro三个参与抑制RNA沉默氨基酸位点的鉴定    王洁;刘金亮;阴筱;高瑞;李向东;刘焕庭;

放射性标记对小干扰RNA在体内分布的无创性示踪研究    康磊;王荣福;闫平;

棉花总RNA的快速提取方法    王峰;张秋平;陈金湘;

RNA干扰环氧化酶2对人腰椎退变终板软骨细胞生长增殖及凋亡的影响    赵庆华;田纪伟;王雷;董双海;王震;刘诚袆;

液相芯片技术在小分子RNA检测分析中的应用    孙凯;汪谦;

聚丙烯/木质素复合材料制备及性能    戴洪湖;陈枫;杨晋涛;费正东;钟明强;

Sox2 RNA探针的制备及其mRNA在早期鸡胚中的原位杂交检测    张晖;覃君慧;柳金雄;冯亚玫;陈秋生;

hALP,一个新的t-UTP,通过结合并乙酰化UBF促进RNA Pol I的转录    孔瑞瑞;

RNA：纵是配角也精彩    聂翠蓉

新技术让研究进入单细胞内RNA的世界    记者 常丽君

RNA干扰技术成明日黄花？    伊瑶

科学家发现控制个体稳定的RNA片段    王小龙

微小RNA揭开心律失常之谜的“金钥匙”    本报记者 衣晓峰　聂松义 通讯员 陈英云

RNA干扰机制首次在人体中获得证实    冯卫东

新RNA转录变体可简化生物线路    记者 常丽君

细胞“垃圾”也能变废为宝    记者 聂翠蓉

病毒会利用微RNA对人体实施攻击    记者 刘海英

赛默飞世尔启动RNA干扰研究/药物筛选资助项目    陈蕾

木质素的提取及在聚氨酯中的应用    曲玉宁

木质素酚醛泡沫保温材料的制备与性能研究    胡立红

木质素新型模型物的合成及其在木质素结构研究中的应用    岳凤霞

纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因治疗大肠癌的实验研究    于丽

单链抗体介导狂犬病毒shRNA靶向制剂的研究    杨瑞梅

水稻条纹病毒（RSV）RNA3、RNA4的克隆与抗RSV转基因水稻的培育    马进

RNA干扰抑制基质金属蛋白酶对小鼠动脉粥样硬化影响的实验研究    金哲秀

秸秆酶解木质素液化改性及聚氨酯发泡材料制备研究    李燕

木质素解聚新工艺及机理研究    叶跃元

木质素及其模型物在不同热化学环境下的解构    刘江燕

RNA干涉ZmCoA基因对玉米秸秆木质素含量及组分影响的研究    陈文娟

RNA干扰抑制的肉桂酰辅酶A还原酶和咖啡酸转移酶还原酶对单参木质素沉积及水溶性次生代谢物影响    刘晓晶

氨水循环爆破法对玉米秸秆预处理效果的研究    张超

魔芋葡甘聚糖复合材料的制备研究    戴勋

能源植物木质素组成结构对降解转化效率影响的研究    赵春桥

两种改良溶剂法提取松木木质素的研究    王华

聚丙烯/木质素复合材料的制备及性能研究    董晓莉

大麻纤维生物漂白工艺研究    岳升彩

亚麻木质素和纤维素合成相关基因部分序列的克隆    高原

黄瓜花叶病毒2b蛋白在RNA沉默通路中的作用方式研究    李喜英