玉米秸秆腐解复合菌系YM-1的构建及其降解性能研究

【摘要】：本文针对北方玉米秸秆还田地区秸秆降解速度缓慢，从而影响下茬作物生长的状况，以山东德州、泰安等地玉米秸秆连续多年还田的土壤样品为菌源，筛选具有降解纤维素能力的菌株，通过菌株间拮抗试验构建复合菌系YM-1，通过液体、固体发酵试验中菌系的CMC酶活、滤纸酶活、木聚糖酶活和PCR-DGGE监测菌群的动态变化，评价YM-1的功能及其组成稳定性；最后通过模拟田间试验评价复合菌系YM-1的应用效果。论文的主要结果如下： 1）采用CMC-刚果红染色法从土壤中分离筛选了15株产纤维素酶菌株，在对其进行低温诱导试验中发现菌株M11在13℃低温环境下仍能高效分解纤维素，鉴定M11为草酸青霉（Penicillium oxalicum）。发酵试验表明：以玉米秸秆粉为唯一碳氮源，13℃、200r/min摇床发酵培养9d时，纤维素酶活力最高为33.08U/mL。对其酶学性质初步研究表明该酶最适pH为5.0，最适反应温度为20℃，在5℃~20℃间酶活力仍能保持在90%以上。 2）根据液体发酵中各菌株纤维素酶活力大小，从上述15株菌中筛选出4株产酶能力较高的菌株X11、M11、M14、F7，将它们与对照菌株里氏木霉DSM768（南京农业大学资源与环境学院赠送）及实验室保存的具有降解玉米秸秆的复合菌系CSS-1组配得到新的复合菌系YM-1。 3）采用液体发酵试验研究复合菌系YM-1的产酶能力、结果表明：复合系YM-1在28℃、200r/min条件下液体发酵培养7d时CMC酶活力达到最大值29.87U/mL，滤纸酶活力为17.14U/mL，第9d时木聚糖酶活力最大为23.6U/mL，发酵液的pH值随时间的延长呈先下降后升高的趋势。 4）菌系YM-1的功能稳定性：针对F10、F15、F20代固态发酵产物测得的纤维素酶活力及木聚糖酶活力，结果表明在复合菌系YM-1腐解过程中，不同代的复合系酶活变化幅度较小，各代酶活曲线的变化基本相同，都呈现出由低到高再降低的趋势，说明复合菌系的产酶能力非常稳定。 5）菌系YM-1的组成稳定性及多样性分析：采用PCR-DGGE分析YM-1的F2、F5、F10、F15、F20、F25代菌种组成，结果表明不同继代复合菌系中细菌与真菌的组成稳定；DGGE条带回收分析后发现：F15代不同发酵时间内DGGE条带亮度与呈现的位置是不同的，菌系中的微生物组成具有多样性。 6）在模拟田间试验中，采用失重率法测定不同处理下玉米秸秆的失重率，结果表明：对照、复合菌系YM-1、CSS-1及菌剂A处理的秸秆干重都有所降低，对照秸秆失重率为13.1%，菌剂A为19.5%，CSS-1为30.6%，而YM-1的失重率最高达到36.9%，说明复合菌系YM-1对玉米秸秆具有较强的降解能力。 7）在模拟田间试验中，采用BIOLOG生态板测定不同处理的AWCD（微平板孔内平均颜色变化率）来分析腐解微生物的代谢活性，YM-1处理的AWCD曲线在12h~96h范围内斜率最大，后期168h的AWCD值最高达3.69；菌剂A、CSS-1和对照的AWCD最大值分别为3.03、2.80和2.78。说明YM-1处理中微生物的代谢活性最高。 【关键词】：低温 复合菌系YM-1 纤维素酶 木聚糖酶 PCR-DGGE
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S141;S38
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 绪论11-28
• 1.1 秸秆资源及利用概况12-17
• 1.1.1 秸秆资源及组成12-14
• 1.1.2 秸秆的利用现状14-16
• 1.1.3 秸秆资源化利用过程中存在的问题16-17
• 1.2 秸秆还田技术研究进展17-19
• 1.2.1 国内外秸秆还田技术研究进展17
• 1.2.2 秸秆还田效应研究17-19
• 1.3 秸秆降解的酶学及微生物学研究19-21
• 1.3.1 降解作物秸秆的酶类19-20
• 1.3.2 降解秸秆的微生物20-21
• 1.4 秸秆腐解复合菌系研究进展21-23
• 1.4.1 秸秆复合菌系的研究概况21-22
• 1.4.2 秸秆复合菌系研究存在的问题与解决措施22-23
• 1.5 分子生态学技术在复合菌系筛选中的应用23-27
• 1.5.1 变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术23-26
• 1.5.2 Biolog 技术简介26-27
• 1.6 本论文研究目的与意义27-28
• 第二章 纤维素降解菌株的筛选与鉴定28-40
• 2.1 试验材料28-29
• 2.1.1 土样28
• 2.1.2 对照菌株28
• 2.1.3 玉米秸秆粉28
• 2.1.4 培养基28-29
• 2.1.5 所需试剂及配制方法29
• 2.1.6 试验设备29
• 2.2 试验方法29-33
• 2.2.1 菌株初筛29-30
• 2.2.2 复筛30-32
• 2.2.3 菌种鉴定32-33
• 2.3 试验结果与分析33-38
• 2.3.1 菌株筛选33-34
• 2.3.2 菌株复筛34-36
• 2.3.3 菌株鉴定36-38
• 2.4 讨论38-40
• 第三章 低温产纤维素酶菌株的筛选及酶学性质研究40-48
• 3.1 试验材料40-41
• 3.1.1 供试菌株与对照菌株40
• 3.1.2 所需试剂40
• 3.1.3 培养基40-41
• 3.2 试验方法41
• 3.2.1 温度梯度诱导41
• 3.2.2 酶活力测定41
• 3.2.3 M11 菌株生长特性41
• 3.2.4 M11 菌株酶学性质初步研究41
• 3.3 结果和分析41-46
• 3.3.1 低温产纤维素酶菌株的筛选41-43
• 3.3.2 菌株形态学43-44
• 3.3.3 M11 菌株生物学鉴定结果44
• 3.3.4 菌株 M11 生长曲线44-45
• 3.3.5 菌株 M11 纤维素酶学性质45-46
• 3.4 讨论46-48
• 第四章 玉米秸秆腐解复合菌系 YM-1 的构建与降解特性研究48-65
• 4.1 试验材料48-50
• 4.1.1 试验菌株48
• 4.1.2 培养基48-49
• 4.1.3 所需试剂及配制方法49
• 4.1.4 主要仪器及设备49-50
• 4.2 试验方法50-53
• 4.2.1 复合菌系 YM-1 的构建50
• 4.2.2 复合菌系 YM-1 的降解特性50
• 4.2.3 复合菌系 YM-1 功能与组成稳定性研究50-53
• 4.3 试验结果与分析53-63
• 4.3.1 复合菌系 YM-1 的构建53-54
• 4.3.2 YM-1 的降解特性54-57
• 4.3.3 菌系 YM-1 降解功能稳定性57-58
• 4.3.4 菌系 YM-1 组成稳定性及微生物动态分析58-63
• 4.4 讨论63-65
• 第五章 实验室模拟田间降解效果研究65-69
• 5.1 试验材料65
• 5.1.1 供试菌系65
• 5.1.2 种子培养基65
• 5.1.3 其他材料65
• 5.2 试验方法65-67
• 5.2.1 种子液制备65
• 5.2.2 模拟田间试验65-66
• 5.2.3 秸秆失重率的测定66
• 5.2.4 微生物菌群分析66-67
• 5.3 试验结果与分析67-68
• 5.3.1 秸秆失重率测定67
• 5.3.2 不同处理条件下秸秆腐解微生物的 AWCD 分析67-68
• 5.4 讨论68-69
• 第六章 结论69-71
• 6.1 本论文的主要结论69
• 6.2 存在的问题与建议69-71
• 参考文献71-77
• 在读期间已发表论文77-78
• 作者简历78-79
• 致谢79-80

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