以油菜秸秆为主要基质发酵生产盾壳霉分生孢子的工艺改进

【摘要】：核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib．)de Bary]引起的作物菌核病是一种世界性分布的顽固性病害，重寄生菌盾壳霉(Coniothyrium minitans)是一种应用前景广阔的生防菌。制备大量而且有活性的盾壳霉分生孢子是将其应用于生产实践的前提条件。王英超等(2005)证明油菜秸秆中营养较丰富，是生产盾壳霉分生孢子很好的固体发酵底物，而且该工艺条件要求不高，原材料易得，配料简单，产品成本较低，有一定的推广实用价值，具有市场开发潜力。 本课题就以低廉的油菜秸秆粉碎物为主要基质，另添加玉米粉和麸皮来发酵生产生物农药盾壳霉(Coniothyrium minitans)，对筛选的固体发酵培养基及发酵条件进行了优化，并对储存期间固体发酵生产的盾壳霉孢子进行了质量评估，最后对其防病潜力进行了研究。结果如下： 本研究以野生型盾壳霉菌株Chy-1为研究对象，产孢量为指标，并考虑到生产成本等问题，进行了盾壳霉分生孢子的固体发酵培养基的筛选试验。在三角瓶(250ml)培养的条件下，通过单因子试验和正交优化法获得了盾壳霉固态发酵的最佳培养基基质配方为(重量百分比)：油菜秸秆粉71％、玉米粉23％、麸皮6％。试验发现，培养基的成份及其用量对盾壳霉产孢具有很大的影响，同时将油菜秸秆粉碎也缩小了基质占用空间。 实验室水平上，在三角瓶内培养：每瓶装料量15g，当混合干料与水的比例(g：ml)为1：3～1：5时，最适接种量为10~6～10~7个孢子／g初始基质，发酵15d后盾壳霉分生孢子平均产量达到3.3×10~9孢子／g干物质；塑料袋(直径17cm，长33cm)扩大培养：每袋装料量为50g，培养基初始含水量仍为干料：水份=1：3时，发酵20d后孢子产量达到2.5×10~9孢子／g干物质，比单独利用油菜秸秆发酵(0.88×10~9孢子／g干秸秆)提高了约5倍。 同时对盾壳霉产孢过程中的影响因子进行了分析。结果发现当堆积的发酵袋周围环境温度稳定在22.5℃左右时，随着培养时间的延长发酵袋内的温度逐渐上升，基本恒定在22～24℃范围内，而盾壳霉生长适温是20℃，据重复测定此温度范围正好与盾壳霉生长产孢所要求的温度范围一致；发酵基质中的含水量对盾壳霉产孢有明显影响，盾壳霉在培养期间由于呼吸不断加强及代谢热的产生，发酵袋内培养料中的水分不断蒸发，随着培养时间的延长基质含水量逐渐下降，但变化都比较平缓；测定了发酵期间盾壳霉对底物的消耗状况，经方差分析发现培养20～30天期间，发酵底物减重与盾壳霉产孢量的变化基本一致，由此说明到培养后期(30天后)，盾壳霉生长开始减慢，代谢减弱，发酵温度与基质含水量基本保持不变，对基质营养的利用也开始下降。采用稀释涂PDA平板法测定了不同发酵期间(10～30天)盾壳霉孢子的萌发率，发现发酵的盾壳霉分生孢子24h的平均萌发率均在80％左右，但最终萌发水平(36h～48h的孢子萌发率)均达90～100％，经方差分析各发酵期间彼此差异性不明显。 本研究将发酵获得的盾壳霉固体发酵物不经过孢子提纯，分干燥与不干燥两种处理直接储存，检测了温度(4℃、20℃、28℃)对发酵盾壳霉孢子粉长期存活及毒力的影响。就两个方面进行分析：孢子萌发率及寄生菌核分析。首先比较了两种不同处理的盾壳霉发酵孢子粉在不同温度条件下储存后的萌发情况，于PDA平板上培养进行24h和36h的萌发测定。从孢子萌发的变化曲线可明显看出，存储前(0天)未干燥发酵孢子粉(即新鲜孢子液)比干燥发酵孢子粉萌发率(36h)高，彼此无明显差异；在4℃下两种发酵孢子粉经较长时间(5～6个月)的储存都保持着较高的萌发水平，干燥发酵孢子粉仍有43.4％的活孢率，与未干燥发酵孢子粉(57.5％)无明显差异；而20℃、28℃条件下储存的孢子萌发率随时间变化均呈降低的趋势，而且未干燥发酵孢子粉萌发率显著低于经干燥过的发酵孢子粉(24h和36h)，存储4个月后，未干燥发酵孢子粉萌发力几乎丧失。同时检测了两种不同处理的孢子粉在存储期间对核盘菌菌核的寄生致腐情况。结果发现：不同盾壳霉孢子液处理过的菌核在湿沙培养皿中20℃培养2个月后都引起菌核不同程度的腐烂。存储前(0天)经风干干燥后与未干燥的相比，相同浓度处理的盾壳霉孢子对菌核寄生的腐烂指数没有差异，而且使用较低浓度(10~3孢子／ml)的处理对菌核也有相当强的致腐能力。在存储期间，4℃下保存的两种发酵孢子粉相同浓度的盾壳霉孢子液处理的菌核腐烂指数都明显高于20℃、28℃条件下保存的。而且20℃条件下储存的未干燥发酵孢子粉4个月后萌发率开始急剧下降，对菌核几乎无寄生致腐作用；而干燥发酵孢子粉储存6个月后，虽然孢子萌发率很低，但仍有寄生菌核的能力。所以经干燥处理的比未干燥的孢子存活期长。 各储存温度下，随着储存期的延长，盾壳霉孢子的萌发率与寄生致腐菌核的能力逐渐下降，经方差分析，两种盾壳霉发酵孢子粉10~7孢子／ml与10~5孢子／ml处理的菌核腐烂程度都较高，彼此差异性不明显，但明显高于10~3孢子／ml处理，说明使用10~5～10~7孢子／ml的盾壳霉孢子含量就能达到致腐菌核的目的，也为田间使用盾壳霉发酵物防治作物菌核病害提供了依据。 将盾壳霉以固体发酵物形式或配制成孢子液作为接种物施入到油菜土壤当中，发现使用相同剂量(10~5个孢子／g土壤)时，都能显著地控制核盘菌菌核的萌发，降低菌核的成活数量。从收获后的油菜籽产量来看，将盾壳霉发酵物直接使用到土壤当中比对照(未加盾壳霉的处理)也有了提高。 本试验将固体发酵获得的盾壳霉原菌粉直接混合应用于土壤当中，无须提纯其分生孢子或制备成菌剂，这样既节约成本，又能够使秸秆还田，不会造成环境污染，同时也达到了防治病害持久性的目的。所以认为利用油菜秸秆固体发酵盾壳霉具有广泛的发展前景。 【关键词】：盾壳霉 核盘菌 油菜秸秆 固体发酵 孢子质量评估 生物防治
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S476
【目录】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 第一章 文献综述14-24
• 1 核盘菌的研究进展14-16
• 1.1 核盘菌的寄主范围及危害14
• 1.2 核盘菌的生物学特性14-15
• 1.3 作物菌核病的防治15-16
• 2 生防菌盾壳霉的研究进展16-22
• 2.1 盾壳霉的生物学特性17
• 2.2 盾壳霉的生态学特性17-18
• 2.3 盾壳霉的防病潜力18-20
• 2.4 盾壳霉的规模化生产及应用20-22
• 2.4.1 盾壳霉的固体发酵生产20-21
• 2.4.2 发酵条件的优化研究21-22
• 3 本课题研究的意义22
• 4 本课题研究的目的和内容22-24
• 第二章 盾壳霉分生孢子固体发酵培养基的筛选及条件优化24-36
• 1 材料与方法24-25
• 1.1 供试盾壳霉菌株及接种体制备24
• 1.2 供试培养料及其制备24
• 1.3 培养条件24-25
• 1.4 发酵培养基的筛选25
• 1.5 盾壳霉分生孢子产量的测定25
• 1.6 数据统计分析25
• 2 结果与分析25-34
• 2.1 添加玉米粉和麸皮对盾壳霉分生孢子产量的影响25-26
• 2.2 油菜秸秆粉-玉米粉-麸皮发酵培养基的优化26-30
• 2.3 培养基初始含水量的确定30
• 2.4 接种量对盾壳霉产孢的影响30-31
• 2.5 培养时间对盾壳霉产孢的影响31-34
• 3 小结和讨论34-36
• 3.1 小结34
• 3.2 讨论34-36
• 第三章 袋装料发酵盾壳霉的研究36-44
• 1 材料及方法36-37
• 1.1 供试材料36
• 1.2 盾壳霉接种体的制备36-37
• 1.3 基质含水量的测定37
• 1.4 发酵物中孢子含量的测定37
• 1.5 数据统计分析37
• 2 袋装料发酵盾壳霉的条件研究37-39
• 2.1 发酵时间对袋发酵培养盾壳霉产孢的影响37-38
• 2.2 发酵基质减重的测定38
• 2.3 发酵过程中温度的变化38
• 2.4 不同发酵时间盾壳霉分生孢子的萌发率测定38-39
• 3 结果与分析39-42
• 3.1 塑料袋封口塞的选择39
• 3.2 发酵时间对袋发酵培养盾壳霉产孢的影响39-40
• 3.3 发酵期间盾壳霉对底物的消耗状况40-41
• 3.4 发酵过程中温度的变化41
• 3.5 不同发酵期间孢子的萌发测定41-42
• 4 讨论42-44
• 第四章 盾壳霉固体发酵物中分生孢子的质量评估44-53
• 1 材料与方法44-46
• 1.1 供试真菌菌株44
• 1.2 盾壳霉发酵物的培养44
• 1.3 核盘菌菌核的培养44
• 1.4 盾壳霉分生孢子处理44-45
• 1.5 盾壳霉活孢率的测定45
• 1.6 温度对盾壳霉孢子储存稳定性的影响45
• 1.7 盾壳霉对核盘菌菌核的寄生致腐作用测定45-46
• 1.8 数据统计分析46
• 2 结果与分析46-51
• 2.1 温度对盾壳霉孢子储存稳定性的影响46-49
• 2.1.1 不同温度下未干燥的发酵孢子粉中盾壳霉孢子的存活研究46-47
• 2.1.2 不同温度下干燥发酵孢子粉中盾壳霉孢子的存活研究47-48
• 2.1.3 4℃条件下保存的发酵孢子粉中盾壳霉孢子的存活比较48-49
• 2.2 盾壳霉对核盘菌菌核的寄生致腐情况49-51
• 2.2.1 干燥发酵孢子粉对核盘菌菌核的寄生致腐分析49-50
• 2.2.2 20℃条件下保存的盾壳霉分生孢子对核盘菌菌核的寄生致腐作用50-51
• 3 讨论51-53
• 第五章 盾壳霉固体发酵物控制核盘菌菌核萌发的效果53-57
• 1 材料与方法53-54
• 1.1 材料53
• 1.2 盾壳霉发酵物的制备53
• 1.3 盾壳霉孢子悬浮液的制备53
• 1.4 核盘菌菌核培养53-54
• 2 田间盆栽试验设计54
• 2.1 盆栽接种试验54
• 2.2 油菜产量的调查与统计54
• 3 结果与分析54-55
• 4 讨论55-57
• 参考文献57-65
• 致谢65

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