利用秸秆水解液的微生物暗发酵产氢特性及机制研究

【摘要】：秸秆类木质纤维素以其数量大、价格低廉、可再生、获取容易等诸多优点成为暗发酵生物制氢潜在的适宜底物。利用秸秆类物质进行生物制氢可以大大降低氢气的生产成本,使生物制氢在经济上更具有可行性,同时避免了秸秆类物质通常的焚烧处理导致的严重环境污染。然而,秸秆类物质具有高结晶度、高异质性的复杂结构,致使微生物对其的直接降解效率较低。因此,利用富含戊糖、己糖的秸秆水解液进行微生物发酵产氢成为生物制氢产业化应用的重要发展方向。目前,在混合微生物进行秸秆水解液发酵产氢过程中,存在着底物降解不充分,产氢效率较低等瓶颈问题,严重阻碍了秸秆水解液产氢的生产规模应用。另一方面,对秸秆水解液利用过程中的微生物产氢分子机制亦不清楚,难以从理论层面指导实际产氢工艺的运行过程。 基于此,本研究考察了种泥预处理和发酵温度对不同类型混合微生物利用秸秆水解液产氢过程的影响。为提高系统的底物降解率与产氢能力,采用对秸秆水解液具有高效降解、产氢能力的菌株Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16对混合微生物利用秸秆水解液产氢过程进行了生物强化。通过扩增片段长度多态性(AFLP)和木质纤维素降解基因分析阐述了T.thermosaccharolyticum类型微生物在秸秆类物质利用过程中的分子机制。对菌株W16的[FeFe]-氢化酶基因簇进行了基因克隆、特征分析与转录表达分析,解析了T. thermosaccharolyticum类型微生物的产氢机制。 结果表明,热、酸、碱、超声和紫外五种预处理方法中,热预处理对活性污泥、河流底泥和颗粒污泥中混合微生物的产氢过程具有较好提升效果,热预处理下的活性污泥接种达到了最大的氢气产量5.03mmol/g-sugar utilizedo在不同发酵温度(30℃、37℃、55℃、70℃)中,55℃时三种类型种泥均达到最高氢气产量,颗粒污泥接种时数值最大(7.74mmol/g-sugar utilized),而70℃时混合微生物对秸秆水解液的产氢效能显著低于55℃。预处理过程和高温条件显著改变了微生物群落结构,使之由Enterobacter spp.、Escherichia spp.、 Klebsiella spp.等兼性微生物的普遍存在,转变为Clostridium spp.、 Bacillus spp. Thermoanaerobacterium spp等高效厌氧产氢微生物的大量富集。 菌株W16的生物强化作用可以显著提升腐烂秸秆和厌氧污泥接种时混合微生物利用秸秆水解液过程的氢气产量,同时一定程度提高了底物降解率,生物强化下的腐烂秸秆接种达到最高的氢气产量9.90mmol-H2/g-sugar utilized。AFLP分析显示T. thermosaccharolyticum类型微生物具有较高的基因组DNA保守性,差异条带中的2-polyprenylphenol6-hydroxylase基因可能为T.thermosaccharolyticum类型微生物较强木质纤维素降解能力的关键因素。此外,在T. thermosaccharolyticum中的木质纤维素降解基因中,Cellulose1,4-beta-cellobiosidase基因中-10区RNA聚合酶结合位点处的单碱基差异可能与T. thermosaccharolyticum类型微生物对纤维素的利用效果密切相关。 克隆得到了菌株W16[FeFe]-氢化酶hyd和hfs基因簇的完整DNA序列,分别包含hyaⅡ (1308bp)、 hydC (480bp)、 hydD (363bp)、 hydB (1788bp)和hydA (1752bp),以及hfsA (243bp)、hfsB (1716bp)和hfsC (1512bp),其中hyaⅡ、hydB、 hydA、hfsB和hfsC为较重要的氢化酶基因。分析了hyd和hfs基因簇中各基因的DNA序列特征、对应蛋白质的物理化学性质、二级和三级结构、结构功能区与保守区。考察不同气相条件(起始N2、H2或CO2灌注)对氢化酶转录表达的影响。对hyd基因簇,hydA的转录过程在高H2或高CO2分压下被严重抑制；hyaB只对高H2分压较为敏感；hyaⅡ在高N2、高H2或高CO2分压下都表达量较低。对hfs基因簇,hfsB在高CO2分压下表现出较高的转录活性,在高H2分压下转录表达较低；hfsC基因在高CO2分压下的转录水平最低。 【关键词】：生物制氢 秸秆水解液 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum 生物强化 [FeFe]-氢化酶
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X712
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 目录8-16
• 第1章 绪论16-34
• 1.1 课题背景16-17
• 1.1.1 课题来源16
• 1.1.2 研究的目的及意义16-17
• 1.2 氢能与生物制氢技术17-19
• 1.2.1 氢能的优越性及发展过程17-18
• 1.2.2 氢能的制取方法18-19
• 1.3 发酵法生物制氢技术19-25
• 1.3.1 发酵产氢机理与类型19-21
• 1.3.2 发酵产氢微生物21-22
• 1.3.3 发酵细菌氢化酶及其产氢调控22-24
• 1.3.4 发酵产氢过程影响因素24-25
• 1.4 秸秆类木质纤维素产氢25-29
• 1.4.1 秸秆类木质纤维素结构组成与预处理26-27
• 1.4.2 秸秆类木质纤维素产氢研究现状27-29
• 1.5 生物制氢分子生态学研究现状29-31
• 1.5.1 变性梯度凝胶电泳技术30-31
• 1.5.2 扩增片段长度多态性技术31
• 1.5.3 热不对称交错 P C R 技术31
• 1.6 本课题主要研究内容及技术路线31-34
• 第2章 试验材料与方法34-50
• 2.1 试验材料34
• 2.1.1 试验菌种和产氢种泥34
• 2.1.2 试验底物34
• 2.2 实验试剂与仪器设备34-39
• 2.2.1 主要试剂34-36
• 2.2.2 主要引物36-37
• 2.2.3 主要试剂盒37
• 2.2.4 主要仪器设备37-39
• 2.3 试验方法39-50
• 2.3.1 种泥与秸秆的预处理39
• 2.3.2 培养基配制及间歇培养试验39-41
• 2.3.3 化学分析方法41-42
• 2.3.4 产氢动力学分析42-43
• 2.3.5 核酸提取纯化与克隆43-45
• 2.3.6 微生物群落结构分析45
• 2.3.7 菌株 W16 [FeFe] - 氢化酶基因簇的克隆45-47
• 2.3.8 菌株 W16 [FeFe] - 氢化酶基因转录表达47-48
• 2.3.9 AFLP （扩增性片段长度多态性）试验48-49
• 2.3.10 生物信息学分析49-50
• 第3章 混合微生物利用秸秆水解液发酵产氢影响因素50-86
• 3.1 引言50-51
• 3.2 种泥预处理对秸秆水解液发酵产氢的影响51-68
• 3.2.1 生物气累积与氢气产量51-55
• 3.2.2 产氢过程动力学分析55-57
• 3.2.3 液相末端产物组成57-59
• 3.2.4 微生物群落结构特征59-62
• 3.2.5 微生物种群鉴定与功能分析62-67
• 3.2.6 末端 pH 、生物量、底物利用、氢气产量与平均产氢速率67-68
• 3.3 发酵温度对秸秆水解液发酵产氢的影响68-79
• 3.3.1 生物气累积与氢气产量68-70
• 3.3.2 产氢过程动力学分析70-71
• 3.3.3 液相末端产物组成71-73
• 3.3.4 微生物群落结构特征73-74
• 3.3.5 微生物种群鉴定与分析74-78
• 3.3.6 生物量、末端 pH 、底物利用、氢气产量与平均产氢速率78-79
• 3.4 70 °C 下其他类型种泥利用秸秆水解液发酵产氢79-84
• 3.4.1 生物气累积与氢气产量80-81
• 3.4.2 产氢过程动力学分析81
• 3.4.3 微生物群落结构与种群鉴定81-84
• 3.4.4 生物量、末端 p H 、底物利用、氢气产量与平均产氢速率84
• 3.5 本章小结84-86
• 第4章 T.t hermosaccharolyticum W16 对混合微生物利用秸秆水解液发酵产氢的生物强化与机制86-110
• 4.1 引言86
• 4.2 菌株 W 16 对混合微生物利用秸秆水解液产氢的生物强化86-94
• 4.2.1 生物气累积量与氢气产量87-88
• 4.2.2 液相末端产物组成88-89
• 4.2.3 微生物群落结构特征89-93
• 4.2.4 末端 p H 、底物利用，氢气产量和平均产氢速率93-94
• 4.3 AFLP 技术解析 T.thermosaccharolyticum 类型微生物对秸秆类物质的降解机制94-103
• 4.3.1 菌株基因组 DNA 的提取94-95
• 4.3.2 基因组 DNA 的 EcoRI/MseI双酶切95-96
• 4.3.3 EcoRI / MseI 双酶切产物的预扩增与选择性扩增96-99
• 4.3.4 扩增产物的 AFLP 指纹图谱多态性分析99-102
• 4.3.5 AF LP 指纹图谱条带测序分析102-103
• 4.4 T.thermosaccharolyticum木质纤维素降解基因序列分析103-108
• 4.4.1 木质纤维素降解基因的 PCR 扩增103-105
• 4.4.2 纤维素降解基因的序列比较分析105-106
• 4.4.3 半纤维素降解基因簇的序列比较分析106-108
• 4.5 本章小结108-110
• 第5章 T.thermosaccharolyticum W16 [FeFe]- 氢化酶基因簇克隆与转录表达110-144
• 5.1 引言110
• 5.2 [ FeFe]-氢化酶 hyd 基因簇的克隆、鉴定与分析110-126
• 5.2.1 基因保守区克隆111-113
• 5.2.2 基因全长克隆113-114
• 5.2.3 核酸序列分析114-118
• 5.2.4 编码蛋白序列分析与特性预测118-121
• 5.2.5 基因功能区与编码蛋白保守区分析121-126
• 5.3 高效产氢菌 W16 [ FeFe]-氢化酶 hfs基因簇的克隆与分析126-135
• 5.3.1 基因保守区克隆126-127
• 5.3.2 基因全长克隆127
• 5.3.3 核酸序列分析127-129
• 5.3.4 编码蛋白序列分析与特征预测129-131
• 5.3.5 基因功能区与编码蛋白保守区分析131-135
• 5.4 不同气相条件下菌株 W16 发酵产氢与关键氢化酶基因表达135-142
• 5.4.1 气相组成136-137
• 5.4.2 生物气累积与氢气产量137-138
• 5.4.3 氢气产生速率与生物量增长趋势138
• 5.4.4 液相末端产物组成138-139
• 5.4.5 重要氢化酶基因转录表达139-141
• 5.4.6 pH 、底物利用、氢气产量和最大产氢速率141-142
• 5.5 本章小结142-144
• 结论144-146
• 参考文献146-161
• 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果161-164
• 致谢164-165
• 个人简历165

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