水稻秸秆纤维素发酵转化燃料乙醇的研究

【摘要】： 我国水稻秸秆资源丰富,年产量达3亿多吨。利用水稻秸秆生产燃料乙醇,对解决未来我国能源问题、实现节粮代粮和环保有着巨大的潜力和广阔的应用前景。水稻秸秆的主要成分是纤维素,对纤维素的利用最主要的限制性因素是将纤维素转化为可发酵还原糖。解决的办法主要有两类途径:(1)提高纤维素酶生产的经济性,主要涉及纤维素酶高产菌的获得及纤维素酶的生产技术,提高其合成效率以降低单位纤维素酶生产成本;(2)提高纤维素酶利用效率,主要涉及纤维素酶解催化过程,以降低单位可发酵还原糖生产成本。因此,本研究从菌种的选育着手,研究了菌株的产酶特性,用响应面策略优化发酵培养基,形成了5L发酵罐分批发酵生产高活力纤维素酶技术;分离纯化了纤维素酶;构建了代谢纤维二糖的酿酒酵母工程菌;对酿酒酵母工程菌细胞固定化发酵进行了研究,利用二级串联式生物反应器耦合系统生物协同酶解水稻秸秆发酵生产燃料乙醇等。主要研究结果如下: 1.筛选到一株纤维素酶高产菌株(Penicillium YT01),原生质体紫外诱变后得到突变株YT02,YT02以水稻秸秆为碳源,豆饼粉和硫酸铵为氮源,在29℃,初始pH6.0发酵120 h,纤维素酶活力达到最高,摇瓶发酵滤纸酶活(FPA)、CMC酶活(CMCase)和β-葡萄糖苷酶活(CB)分别达3.86 IU/mL、207.41 IU/mL和1.40 IU/mL。 2.用响应面方法(RSM)优化的发酵培养基组成为:水稻秸秆为41.95g/L,豆饼粉为24.83g/L,麸皮为22.16 g/L,(NH_4)_2SO_4、KH_2PO_4为4g/L,MgSO_4为0.5g/L;起始pH6.0。以优化的培养基发酵120 h,滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活分别达到8.8967IU/mL、357.41 IU/mL and 3.704 IU/mL。远高于优化前的纤维素酶活水平。 3.在5L发酵罐中研究了温度、pH值和溶氧对菌体生长和产酶的影响,确定了分批发酵的工艺条件为:0-32 h时发酵温度32℃,溶氧70%;32 h至120 h发酵结果发酵温度29℃,溶氧50%,发酵液初始pH值6.0,发酵96 h滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活分别达到11.13 IU/mL、465.24 IU/mL and 4.08 IU/mL,均高于摇瓶发酵水平,分批发酵动力学过程显示,突变菌YT02菌体生长和纤维素酶各组分均为部分耦联。 4.利用DEAE Sephadex A-25和Sephadex G-75分离纯化了二个内切葡聚糖酶(CMCase)和一个β-葡萄糖苷酶,CMCase纯化倍数为13.48,回收率为10.54%,β-葡萄糖苷酶纯化倍数为18.62,回收率为8.62%,经SDS-PAGE得到单蛋白分子条带,经分子量测定分别为73 kDa、43 kDa和57.8 kDa,并对其进行了N端测序和质谱分析。 5.以生产乙醇性能优良的酿酒酵母菌株NAN-27作为工程菌株的受体菌。利用稳定性能良好的多拷贝整合型载体pYMIKP,使纤维二糖代谢基因BGL1整合到酿酒酵母的染色体上。从而在酿酒酵母工业菌株中建立了稳定的纤维二糖代谢途径,拓展了酒精生产的底物利用范围,降低了纤维二糖对纤维素酶解的抑制作用。采用海藻酸钙凝胶包埋固定代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌,固定化细胞与游离细胞相比,发酵时间缩短,乙醇产率提高20%以上,并能有效地利用水稻秸秆水解液进行酒精发酵。 6.对水稻秸秆酶解过程中底物性质、酶解温度、酶解pH、底物浓度及纤维素酶用量等关键因子进行了研究。由于YT02纤维素酶系中纤维二糖酶活力较低(CB/FPA为0.38),经稀酸稀碱预处理后的水稻秸秆纤维素对乙醇转化率仅为18%。采用代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌游离细胞发酵,可部分去除纤维二糖对酶解的抑制,水稻秸秆纤维素对乙醇转化率可提高至20%。进一步利用采用海藻酸钙凝胶包埋固定代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌发酵,水稻秸秆纤维素对乙醇转化率可达26%。这方面的研究结果有助于深入了解纤维素酶的协同降解机制。 7.将纤维原料的酶解、固定化代谢纤维二糖酿酒酵母工程菌的作用有机耦联,构建成新型的二级串联式生物反应器,在该反应器体系的协同作用下,可有效解除纤维二糖和葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用,促进纤维原料水稻秸秆的酶水解,发酵40 h,乙醇浓度达25.5g/L,纤维素对乙醇的转化率达43.0%(纤维素对乙醇的理论转化率为56.61%),是游离细胞同时糖化发酵(SSF)的1.65倍,生产效率达0.64g/(L·h)。采用分批添料式协同酶解发酵工艺,可提高纤维底物的终浓度达250g/L,产物乙醇的终浓度66.51g/L,有效提高了纤维素酶的利用率和乙醇生产效率,降低乙醇的生产成本。该反应器性能稳定,反应效率高,固定化细胞可以重复使用,便于自动化控制。 【关键词】：纤维素酶 水稻秸秆 酿酒酵母 燃料乙醇 串联式生物反应器
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：S216.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-16
• 第一章 文献综述16-38
• 1 水稻秸秆资源及其降解方式16-21
• 1.1 水稻秸秆的组成与结构16-18
• 1.2 水稻秸秆的预处理18-19
• 1.2.1 物理方法预处理水稻秸秆18
• 1.2.2 化学方法预处理水稻秸秆18-19
• 1.2.3 生物方法预处理水稻秸秆19
• 1.3 水稻秸秆纤维素的降解方式19-21
• 1.3.1 水稻秸秆的酸水解20
• 1.3.2 水稻秸秆的酶水解20-21
• 2 纤维素酶的性质与用途21-27
• 2.1 纤维素酶的多酶体系21-22
• 2.2 纤维素酶的分子结构22-24
• 2.3 纤维素酶的作用机理24-25
• 2.4 纤维素酶的分子量大小25-26
• 2.5 纤维素酶的最适反应条件与稳定性26
• 2.6 纤维素酶的应用26-27
• 3 纤维素酶的生产27-30
• 3.1 纤维素酶的生产菌种选育27-29
• 3.2 纤维素酶的生产29-30
• 4 水稻秸秆原料生物转化燃料乙醇30-34
• 4.1 燃料乙醇的优越性和使用现状30-31
• 4.2 水稻秸秆纤维素生物转化燃料乙醇的方法31-32
• 4.2.1 分步水解发酵法生产燃料乙醇31
• 4.2.2 同步糖化发酵法生产燃料乙醇31-32
• 4.2.3 固定化细胞发酵生产燃料乙醇32
• 4.3 酿酒酵母途径工程应用于燃料乙醇的生产32-34
• 5 本研究的目的、意义和主要内容34-38
• 5.1 本研究的目的和意义34-35
• 5.2 本研究的思路和技术路线35-36
• 5.3 本研究的主要内容36-38
• 第二章 纤维素酶高产菌株的选育及产酶条件研究38-60
• 1 材料与方法38-44
• 1.1 材料38-40
• 1.1.1 试剂与溶液配制38-39
• 1.1.2 菌种与菌种分离源39
• 1.1.3 培养基39-40
• 1.1.4 主要仪器与设备40
• 1.2 方法40-44
• 1.2.1 水稻秸秆的预处理40
• 1.2.2 纤维素酶高产菌的分离与纯化40
• 1.2.3 纤维素酶高产菌的初步鉴定40
• 1.2.4 纤维素酶高产菌的原生质体紫外诱变40-41
• 1.2.5 YT02产纤维素酶的液体发酵培养方法41-42
• 1.2.6 不同预处理水稻秸秆的酶水解42
• 1.2.7 分析方法42-44
• 2 结果与分析44-58
• 2.1 不同预处理水稻秸秆的各组分含量44
• 2.2 纤维素酶高产菌的分离与筛选44-46
• 2.3 纤维素高产菌YT01的菌种鉴定46
• 2.4 纤维素酶高产菌YT01的原生质体紫外诱变46-47
• 2.5 液体发酵培养基成分与发酵条件对YT02产纤维素酶的影响47-56
• 2.5.1 不同碳源对YT02产酶的影响47-48
• 2.5.2 不同预处理水稻秸秆对YT02产酶的影响48-49
• 2.5.3 不同氮源对YT02产纤维素酶的影响49-50
• 2.5.4 微晶纤维素添加量对YT02产纤维素酶的影响50
• 2.5.5 不同无机盐对YT01产纤维素酶的影响50-51
• 2.5.6 起始pH对YT01产纤维素酶的影响51-52
• 2.5.7 装液量对YT02产纤维素酶的影响52
• 2.5.8 转速对YT02产纤维素酶的影响52-53
• 2.5.9 培养温度对YT02产纤维素酶的影响53-54
• 2.5.10 接种量对YT02产纤维素酶的影响54-55
• 2.5.11 培养时间对YT02产酶的影响55-56
• 2.6 纤维素酶的酶学性质研究56-57
• 2.6.1 温度对纤维素酶各组分酶活的影响56
• 2.6.2 pH对纤维素酶各组分酶活的影响56-57
• 2.7 纤维素酶对不同预处理水稻秸秆的酶解试验57-58
• 3 结论与讨论58-60
• 3.1 关于筛选出的纤维素酶高产菌株58
• 3.2 纤维素酶生产菌的改造58-59
• 3.3 青霉YT02产酶条件与酶学特性59-60
• 第三章 YT02产纤维素酶发酵培养基的优化研究60-78
• 1 材料与方法60-62
• 1.1 材料60-61
• 1.1.1 试剂60
• 1.1.2 供试菌种60
• 1.1.3 培养基60-61
• 1.1.4 主要仪器与设备61
• 1.2 方法61-62
• 1.2.1 实验设计61
• 1.2.2 培养方法61
• 1.2.3 分析方法61-62
• 2 结果与分析62-76
• 2.1 部分因子实验筛选发酵培养基的主要影响因子62-65
• 2.2 最陡爬坡实验逼近发酵培养基最优点65-66
• 2.3 中心组合设计优化YT02发酵培养基组成66-74
• 2.4 发酵过程中pH、残余还原糖与纤维素酶变化的测定结果74-76
• 3 结论与讨论76-78
• 第四章 YT02分批发酵产纤维素酶的研究78-91
• 1 材料与方法78-80
• 1.1 材料78-79
• 1.1.1 试剂78
• 1.1.2 菌株78-79
• 1.1.3 培养基79
• 1.1.4 主要仪器79
• 1.2 方法79-80
• 1.2.1 用于分批发酵的种子培养79
• 1.2.2 恒温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响79
• 1.2.3 变温分批发酵对YT02产纤维素酶的影响79
• 1.2.4 溶氧量对YT02分批发酵产纤维素酶的影响79-80
• 1.2.5 分段溶氧对YT02分批发酵产纤维素酶的影响80
• 1.2.6 分析方法80
• 2 结果与分析80-88
• 2.1 发酵温度对YT02产纤维素酶的影响结果80-83
• 2.2 变温发酵对YT02产纤维素酶的影响结果83-84
• 2.3 溶氧对YT02产纤维素酶的影响结果84-87
• 2.4 分段溶氧分批发酵对YT02产纤维素酶的影响结果87-88
• 3 结论与讨论88-91
• 第五章 YT02产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究91-111
• 1 材料与方法91-102
• 1.1 材料91-93
• 1.1.1 试验材料91
• 1.1.2 主要试剂91-92
• 1.1.3 常用储备液及缓冲液92-93
• 1.1.4 主要仪器93
• 1.2 方法93-102
• 1.2.1 蛋白质浓度的测定方法93-94
• 1.2.2 纤维素酶的分离纯化94-98
• 1.2.3 纤维素酶SDS-PAGE凝胶电泳纯化及酶相对分子量的测定98-100
• 1.2.4 酶蛋白的N端测序100-101
• 1.2.5 酶蛋白的质谱分析101-102
• 2 结果与分析102-109
• 2.1 DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析结果102-103
• 2.1.1 层析收集管酶蛋白同洗脱缓冲液NaCl浓度的关系102-103
• 2.1.2 层析收集管酶蛋白活性检测103
• 2.2 Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析结果103-104
• 2.2.1 Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析分离酶蛋白103
• 2.2.2 分子筛凝胶过滤层析纤维素酶活测定结果103-104
• 2.3 纤维素酶各纯化步骤纯化情况104-105
• 2.4 SDS-PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳105-106
• 2.4.1 SDS-PAGE聚丙烯酸胺凝胶电泳银染结果105-106
• 2.4.2 纤维素酶分子量SDS-PAGE凝胶电泳测定结果106
• 2.5 酶蛋白的N端测序结果106-108
• 2.6 酶蛋白的质谱分析结果108-109
• 3 结论与讨论109-111
• 第六章 酿酒酵母纤维二糖代谢途径的构建及其细胞固定化研究111-127
• 1 材料和方法111-118
• 1.1 材料111-113
• 1.1.1 菌株和质粒111
• 1.1.2 分子克隆用酶和试剂111-112
• 1.1.3 水稻秸秆水解液的制备112-113
• 1.2 方法113-118
• 1.2.1 含纤维二糖酶基因(BGL1)的重组质粒pYMIKP-BGL1的构建方法113-114
• 1.2.2 酿酒酵母纤维二糖代谢途径的搭建方法114-116
• 1.2.3 酿酒酵母工程菌细胞的固定化方法116-117
• 1.2.4 固定化酵母细胞发酵方法117
• 1.2.5 分析方法117-118
• 2 结果与分析118-123
• 2.1 表达BGL1基因的重组菌株的构建结果118-120
• 2.1.1 目的基因BGL1的获得118
• 2.1.2 含目的基因BGL1重组质粒的构建118-119
• 2.1.3 酿酒酵母工业菌株NAN-27转化子的获得119
• 2.1.4 转化子NAN-28细胞纤维二糖酶活性测定结果119-120
• 2.2 不同固定化条件对NAN-28细胞固定化的影响结果120-121
• 2.2.1 不同溶剂对固定化细胞转化纤维二搪的测定结果120
• 2.2.2 不同海藻酸钠浓度对固定化细胞凝胶特性的影响120-121
• 2.2.3 酵母包埋量对固定化细胞转化纤维二糖的影响结果121
• 2.3 固定化细胞与游离细胞分批发酵实验结果121-122
• 2.4 固定化细胞重复分批发酵试验结果122-123
• 3 结论与讨论123-127
• 3.1 酿酒酵母纤维二糖代谢途径的构建123-125
• 3.2 酿酒酵母工程菌细胞固定化125-127
• 第七章 串联式生物反应器转化水稻秸秆生产燃料乙醇的研究127-139
• 1 材料与方法127-131
• 1.1 材料127
• 1.1.1 试剂127
• 1.1.2 菌种127
• 1.1.3 主要仪器与设备127
• 1.2 方法127-131
• 1.2.1 稻草粉的预处理127-128
• 1.2.2 纤维素酶的制备128
• 1.2.3 稻草粉的酶解糖化128-129
• 1.2.4 水稻秸秆生物转化燃料乙醇129-130
• 1.2.5 测定方法130-131
• 2 结果与分析131-137
• 2.1 不同预处理方法对水稻秸秆糖化效果的影响结果131
• 2.2 不同温度对水稻秸秆糖化效果的影响结果131-132
• 2.3 不同pH对稻草粉糖化效果的影响结果132-133
• 2.4 不同加酶量对稻草粉糖化效果的影响结果133
• 2.5 不同底物浓度对稻草粉糖化效果的影响结果133-134
• 2.6 水稻秸秆同步糖化发酵(SSF)结果134-135
• 2.7 串联式反应器转化水稻秸秆生产乙醇135-137
• 2.7.1 固定化NAN-28细胞发酵生产燃料乙醇结果135-136
• 2.7.2 串联式生物反应器的稳定性结果136-137
• 2.7.3 分批添料式协同酶解发酵生产燃料乙醇结果137
• 3 结论与讨论137-139
• 3.1 二级串联式生物反应器生产乙醇137-138
• 3.2 分批添料式协同酶解发酵工艺138
• 3.3 水稻秸秆资源的全利用138-139
• 第八章 结论139-141
• 主要参考文献141-161
• 英文缩写与主要符号表161-162
• 本研究的特色与创新162-163
• 发表与待发表的学术论文及成果163-164
• 致谢164-165
• 作者简介165

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纤维素酶固态发酵环境扫描电镜观察    徐福建,陈洪章,邵曼君,李竹川,李佐虎

基质利用和酒精发酵性能改善的重组酿酒酵母    张梁

燃料乙醇发酵技术研究进展    苏小军;熊兴耀;谭兴和;刘明月;

木质纤维生产燃料乙醇工艺的研究进展    王璀璨;王义强;陈介南;李辉;张振华;

玉米秸秆同步糖化共发酵工艺条件优化    刘庆玉;王晓威;张大雷;

水稻秸秆腐解复合菌系RSS-4的选育及其腐解特性    刘甲锋;李力;陈慧君;关大伟;姜昕;李俊;沈德龙;

中科院研发甜高粱燃料乙醇获得实质性进展    柯珏;

云南能源甘蔗开发燃料乙醇的前景分析    张跃彬;

燃料乙醇发展问题与对策研究    齐莹;

国际油价回暖,玉米价格可能上升    孙彤;

贵州能源甘蔗的发展前景    罗亚红;周正邦;周祥;

中国甘蔗燃料乙醇生产的技术、经济和环境可行性分析    曾麟;王革华;

ADH2等位基因缺失的酿酒酵母杂合子的构建    郭晓贤;宋浩雷;江贤章;黄建忠;

我国生物燃料乙醇可持续发展的SWOT分析及战略选择    王晓凌;刘静;

全国变性燃料乙醇和燃料乙醇标准化技术委员会简介    刘钺;

速生杨二步超低酸水解液发酵制取燃料乙醇的研究    袁振宏;庄新姝;王树荣;骆仲泱;吴创之;岑可法;

巴西发展燃料乙醇的经验以及对新疆兵团生物质能建设的启示    李冀新;武冬梅;贾雪峰;

酿酒酵母糖基化过程基因工程改造    周峻岗;祁庆生;王鹏;

酿酒酵母ADH3基因的敲除    宋浩雷;郭晓贤;杨月梅;江贤章;黄建忠;

酿酒酵母YS2-△adh2-△ald6突变株的构建及hxt1基因的过表达    王艳尊;高媛媛;施巧琴;吴松刚;黄建忠;

发展燃料乙醇产业和推广车用乙醇汽油若干问题的思考    乔映宾;

应当十分重视能源甘蔗的育种    翁锦周;洪月云;卢川北;曾日秋;

吉林燃料乙醇生产成本高    杜学静

燃料乙醇：中国新能源战略的重要角色    本报记者 于万夫

发改委加快编制燃料乙醇产业政策    宜班

身陷“争粮”风波 燃料乙醇发展前景迷离    本报记者 吴凡

多渠道推动生物能源开发    陈颐

秸秆“变油”还有多远    本报记者　 陈建军

“玉米制乙醇”冒进,发改委踩刹车    刘铮

玉米乙醇遇红灯丰原生化影响甚微    刘行健

燃料乙醇企业选择“三突围”    王鹏

燃料乙醇替代汽油发展迅速    涣知

水稻秸秆纤维素发酵转化燃料乙醇的研究    杨涛

酿酒酵母海藻糖代谢工程与抗逆性相关机制研究    池小琴

WEB2基因在酿酒酵母S期检查点调控机制中的作用    李新鸣

白念珠菌CaPTC6和CaHXT5基因及酿酒酵母ScATP16基因的功能研究    于立权

酵母表达鲑鱼降钙素基因载体的构建及相关研究    孙平楠

呋喃喹啉类生物碱白鲜碱体外抗真菌活性及作用机制研究    郭娜

鲽形目鱼类生长激素基因的克隆及牙鲆生长激素在酿酒酵母中的表达研究    刘滨

白念珠菌和酿酒酵母菌与TOR信号传导相关的基因功能鉴定    闫智慧

酵母对纤维素乙醇生产中的抑制剂响应的系统生物学研究    李炳志

水稻秸秆降解放线菌的分离鉴定及其降解机理研究    徐杰

纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵    张艳

康氏木霉与酿酒酵母混菌发酵玉米秸秆产乙醇的研究    刘梅

发酵稻草秸秆产燃料乙醇研究    郑颖洁

两株重组酿酒酵母的发酵及一株重组酿酒酵母的初步构建    刘继开

酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的敲除    郭晓贤

SPT3定向进化提高酿酒酵母乙醇耐性的研究    姜如娇

玉米秸秆水解液发酵制取燃料乙醇的研究    曾凡洲

吉林燃料乙醇项目后评价研究    刘晓非

电融合法构建海藻糖高产菌株的研究    彭帅

酵母基微生物絮凝剂性能及作用机制研究    刘敏