甲烷氧化菌（Methylosinus trichosporium）OB3b异源蛋白表达系统的初步研究

【摘要】： Methylosinus trichosporium OB3b是以甲烷为碳源和能源进行代谢的革兰氏阴性细菌,其含有有甲烷单加氧酶(Methane monooxygenase,MMO),其不仅可以用来生产很多高附加值的化工产品,而且可以用于治理环境中难降解污染物,被认为是一种多功能的生物催化剂。MMO酶活不高,催化氧化过程NADH再生不足等因素限制了其应用,对Methylosinus trichosporium OB3b进行基因工程改造是目前普遍采用的方法,但是这些改造方法缺少在M. trichosproium OB3b中表达异源蛋白的研究。本论文以Methylosinus trichosporium OB3b为材料,探索建立该菌的异源蛋白表达系统,旨在为更好的对甲烷氧化菌进行改造奠定基础。 目前对于甲烷氧化菌的基因操作只能依靠接合转导和同源重组来实现,本文通过M. trichosporium OB3b和S17-1(pTJS175)的接合实验,优化了两菌最佳接合细胞密度,结果显示M. trichosporium OB3b的OD540为0.3-0.4,E. coli S17-1的OD600为0.6-0.7为两菌的最佳接合细胞密度。 选择pMMO基因簇下游约500bp基因片段做为异源基因的插入位点,以M. trichosporium OB3b染色体DNA为模版,PCR扩增了该区域并构建了含有卡那霉素抗性基因的自杀载体pSHK,酶切验证显示,pSHK通过电转化的方法成功转入E. coli S17-1中,通过卡那霉素筛选E. coli S17-1 (pSHK)和M. trichosporium OB3b的接合子,未得到期望的突变体,无法通过pSHK在该500bp基因区域引入异源基因,推测是由于所设计的pSHK的同源臂太短或该500bp基因为M. trichosporium OB3b生长关键基因所致。 选择sMMO基因簇上游约5200bp区域做为异源蛋白基因插入位点,以整合型载体pTJS175为出发质粒,构建了含有绿色荧光蛋白gfp基因的表达质粒pJSG,电转化入S17-1中。通过接合的方法,pJSG成功转入到了M. trichosporium OB3b中,PCR验证结果说明,pJSG通过同源臂Arm1和M. trichosporium OB3b的染色体发生了同源单交换,使整个质粒整合到了M. trichosporium OB3b染色体上的sMMO基因簇上游区域。荧光分析结果显示,整合了pJSG的突变体能够表达gfp基因,进一步通过不同Cu2+浓度的条件下培养结果表明,突变体GFP的表达受PmmoX(mmoX启动子)调控,不添加Cu2+时,可以检测到荧光,当添加Cu2+浓度为10μM时,检测不到荧光。 通过以上研究在M. trichosporium OB3b中初步建立了异源蛋白表达系统,为该菌的基因工程改造和异源蛋白表达研究提供了技术支撑。 【关键词】：Methylosinus trichosporium OB3b 异源蛋白表达系统 接合转导 同源重组 绿色荧光蛋白
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-22
• 1.1 引言12
• 1.2 甲烷氧化菌及其分类12-14
• 1.3 甲烷单加氧酶基因及其蛋白结构14-16
• 1.4 甲烷氧化菌 MMO 的调控机制16-18
• 1.5 甲烷氧化菌基因工程研究进展18-19
• 1.6 甲烷氧化菌工业应用研究进展19-20
• 1.6.1 甲烷氧化菌氧化甲烷生产甲醇的研究19
• 1.6.2 甲烷氧化菌氧化丙烯生产环氧丙烷的研究19-20
• 1.6.3 甲烷氧化菌应用于环境治理的研究20
• 1.7 本论文研究的目的、意义、内容及技术路线20-22
• 第二章 接合转导实验最佳细胞密度的优化22-30
• 2.1 引言22
• 2.2 材料和方法22-28
• 2.2.1 菌株22
• 2.2.2 质粒22-23
• 2.2.3 E.coli S17-1 的培养方法23
• 2.2.4 M. trichosporium OB3b 的培养方法23-24
• 2.2.5 E. coli S17-1（pTJS175）和 M. trichosporium OB3b 接合作用原理24-25
• 2.2.6 E. coli S17-1（pTJS175）和 M. trichosporium OB3b 接合条件优化的方法25-26
• 2.2.7 不同生长状态E. coli S17-1（pTJS175）的控制方法26
• 2.2.8 不同生长状态M. trichosporium OB3b 的控制方法26-27
• 2.2.9 突变体的验证方法27
• 2.2.10 接合实验条件的评价方法27-28
• 2.3 结果与分析28-29
• 2.3.1 接合实验中 E. coli S17-1(pTJS175)最佳细胞密度的优化28-29
• 2.3.2 接合实验中 M. trichosporium OB3b 最佳细胞密度的优化29
• 2.4 小结29-30
• 第三章 含有抗生素标记基因突变体的构建30-42
• 3.1 引言30
• 3.2 材料和方法30-36
• 3.2.1 菌株和质粒30
• 3.2.2 菌株的培养方法30-32
• 3.2.3 质粒构建与转化的方法32-33
• 3.2.4 pSHK 质粒的构建策略33-35
• 3.2.5 E. coli S17-1（pSHK/pTJS175)与 M. trichosporium OB3b(甲烷培养)接合的方法35
• 3.2.6 E. coli S17-1（pSHK/pTJS175)与 M. trichosporium OB3b(甲醇培养)接合的方法35-36
• 3.2.7 自杀载体pSHK 与M. trichosporium OB3b 染色体发生同源交换的原理及其突变体的验证方法36
• 3.3 结果与分析36-41
• 3.3.1 pMMO 下游基因和卡那霉素抗性基因的克隆及序列测定36-38
• 3.3.2 自杀载体pSHK 的酶切验证，转化及鉴定38-39
• 3.3.3 转pSHK 的 M. trichosporium OB3b 突变体的筛选39-41
• 3.4 小结41-42
• 第四章 异源蛋白表达系统的构建42-58
• 4.1 引言42
• 4.2 材料和方法42-49
• 4.2.1 菌株和质粒42
• 4.2.2 菌株的培养方法42-44
• 4.2.3 质粒构建与转化的方法44-45
• 4.2.4 pJSG 质粒的构建策略45
• 4.2.5 E. coli S17-1（pJSG）与M. trichosporium OB3b接合的方法45-46
• 4.2.6 突变体的验证方法46
• 4.2.7 整合型载体pJSG 在 M. trichosporium OB3b 染色体中整合位点的分析方法46-48
• 4.2.8 Colorimetric assary 测定sMMO 酶活48
• 4.2.9 荧光检测方法48-49
• 4.3 结果与分析49-58
• 4.3.1 质粒pJSG 的验证，转化及鉴定49-50
• 4.3.2 pJSG 导入 M. trichosporium OB3b 及其突变体的筛选，鉴定50-53
• 4.3.3 pJSG 在M. trichosporium OB3b 染色体中整合位点的分析53
• 4.3.4 M. trichosporium OB3b 突变体的sMMO 酶活检测53
• 4.3.5 M. trichosporium OB3b 突变体的荧光分析53-54
• 4.3.6 铜离子对M. trichosporium OB3b 突变体表达GFP 的影响54-56
• 4.3.7 本章小结56-58
• 第五章 结论58-59
• 参考文献59-65
• 附录 主要实验仪器及试剂65-67
• 一、实验仪器65-66
• 二、化学试剂66
• 三、基因操作酶和试剂盒66-67
• 致谢67-68
• 作者简历68

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