产甲烷条件下高效烃降解菌群的人工构建

【摘要】： 本研究以大港油田埕海一区油层采出液为研究对象,用不同的培养基分别进行发酵型细菌和产甲烷古菌的分离。通过两种不同的培养方式,人工模拟油藏环境中产甲烷条件下的烃降解过程。不断跟踪监测整个烃降解过程中小分子有机酸的含量和甲烷生成量。培养八个月之后,采用PCR-DGGE技术对烃降解培养物进行菌群解析。 本研究最终分离到以HL-3为代表的多株发酵菌和以DL-7为代表的三株氢营养型产甲烷古菌;测序得到数十条细菌和古菌的16S rRNA V3区的片段。菌株HL-3温度生长范围40℃—75℃(最适温度60℃);pH范围5.0—8.0(最适pH 6.5);NaCl浓度范围0%—3.2%(最适NaCl浓度0.25%)。菌株HL-3能够利用葡萄糖、核糖、甘露糖、木糖、纤维二糖等多种碳水化合物,发酵葡萄糖的产物是乙醇、乙酸、CO2及少量丙酸和丁醇。菌株HL-3的(G+C)mol%含量为33.9%,与T.uzonensis DSM18761T(EF530067)的16SrRNA序列相似性为98.8%,与T.sulfurigignens DSM17917T(AF234164)的相似度次之为98.1%。菌株HL-3能够耐受浓度较高的亚硫酸根(0.1 mol/L)离子和浓度极高的硫代硫酸根(0.8 mol/L)。当硫代硫酸根浓度高于0.075 mol/L时,菌体内产生硫单质颗粒;同时,在培养血清瓶顶空中检测到硫化氢气体。嗜热自养产甲烷杆菌DL-7只能够利用H2 /CO2生长,不利用甲酸、甲醇、三甲胺、乙酸和二级醇类;最适生长温度60℃;最适盐浓度0.8g/L ;最适pH为7.0-7.5;只有在添加酵母粉的培养基中才可以生长。菌株DL-7与标准株M. marburgensis DSM2133T(X15364)的16S rRNA基因序列相似性为99.7%。16S rRNA V3区的片段测序结果显示,高温油藏微生物菌群中存在丰富的嗜热厌氧杆菌和氢营养型产甲烷古菌;互营菌是油藏产甲烷条件下烃降解代谢中不可或缺的一类菌。 【关键词】：油藏微生物 热厌氧杆菌 热自养产甲烷杆菌 PCR-DGGE 16SrRNA V3
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：X172
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 绪论11-21
• 1.1 研究背景11-12
• 1.2 研究目的和意义12-13
• 1.3 国内外最新研究进展13-20
• 1.3.1 产甲烷代谢途径是油藏中烃降解的主要代谢途径13-14
• 1.3.2 烃降解的产甲烷代谢途径14-18
• 1.3.3 厌氧烃降解的起始代谢途径的研究18-20
• 1.4 油藏微生物菌群结构的分子生物学研究20-21
• 第二章 油藏中菌群结构的分子生态研究21-36
• 2.1 实验目的及技术路线21-23
• 2.1.1 实验目的21-22
• 2.1.2 技术路线22-23
• 2.2 实验材料23-24
• 2.2.1 样品来源23
• 2.2.2 实验方法23-24
• 2.3 实验结果分析24-34
• 2.3.1 培养过程中甲烷及挥发酸含量测定24-28
• 2.3.2 PCR产物28-30
• 2.3.3 细菌群落结构分析30-32
• 2.3.4 古菌群落结构分析32-34
• 2.4 讨论34-36
• 第三章 油藏中烃降解功能性细菌和古菌的分离、鉴定和代谢特征的分析36-59
• 3.1 样品采集地描述36
• 3.2 实验技术和方法36-41
• 3.2.1 样品采集36-37
• 3.2.2 样品富集37-38
• 3.2.3 分离纯化38-39
• 3.2.4 革兰氏鉴定39
• 3.2.5 形态学研究39
• 3.2.6 生理生化鉴定39-40
• 3.2.7 基因组G+C摩尔含量的测定40
• 3.2.8 16S rRNA 序列的扩增、测序与系统发育学研究40-41
• 3.2.9 发酵型细菌代谢产物分析41
• 3.2.10 硫代硫酸根和亚硫酸根对HL-3 生长代谢的影响41
• 3.3 实验结果41-59
• 3.3.1 初始富集结果41
• 3.3.2 发酵菌的富集分离结果41-42
• 3.3.4 产甲烷菌的富集分离结果42
• 3.3.5 菌株HL-3 的生理生化特征和系统发育学分析42-53
• 3.3.6 菌株DL-7 的生理生化特征和系统发育学分析53-59
• 第四章 全文总结及工作不足与展望59-62
• 4.1 全文总结59-60
• 4.1.1 人工实验室模拟地下原油产甲烷条件下的降解过程和相应微生物菌群的分子生态分析59
• 4.1.2 高温油藏采出水中发酵型细菌的分离鉴定和代谢特征分析59
• 4.1.3 高温油藏采出水中产甲烷细菌的分离鉴定和代谢特征分析59-60
• 4.2 不足与展望60-62
• 4.2.1 油藏的地化分析和系统完整的微生物结构分析60
• 4.2.2 油藏中具有特殊代谢特性的微生物菌株分离60
• 4.2.3 菌株HL-3 和DL-7 的进一步分类学鉴定60-62
• 参考文献62-68
• 致谢68-70
• 作者简历70

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