猪后肠产甲烷菌群多样性及其与乙酸生成关系的研究

【摘要】：产甲烷菌在单胃动物后肠的微生物发酵中起着重要的作用,其能利用微生物发酵产生的氢和二氧化碳生成甲烷,从而使后肠维持较低的氢气压,并促进有机物质的降解。迄今为止,国内外对猪后肠产甲烷菌的研究很少,为丰富人们对猪后肠产甲烷菌的理论认识,了解甲烷菌与乙酸还原菌在氢竞争中的关系；本研究以猪为试验动物,应用16SrRNA基因的克隆分析技术和RFLP分析技术相结合,研究了育肥猪粪便中产甲烷菌的多样性；利用DGGE技术研究了仔猪后肠中的产甲烷菌随时空变化的演变规律；利用体外发酵技术初步探究了仔猪后肠的产甲烷菌与乙酸还原菌的竞争关系。试验分为以下三个部分进行。 1猪后肠中产甲烷菌的多样性研究 采用产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R,建立了猪粪便中的产甲烷古菌的克隆库。共挑取73个克隆,对所挑克隆进行限制性内切酶酶切分类,从分类单元中挑取两个克隆进行测序,所得序列与Genebank上相似序列比对结果显示,与Methanobrevibacter sp. WBY1相似的克隆占总克隆数的43.8%,与Methanosphaera stadtmanae相似的克隆占总克隆数的24.7%,余下克隆属于一类未知的产甲烷古菌,所占比例31.5%。结果说明,猪粪便中的优势菌为甲烷短杆菌属的Methanobrevibacter sp. WBY1,其次为一类未知的产甲烷古菌。 2猪结肠中甲烷菌群多样性的时空变化规律研究 利用基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技术研究了仔猪从哺乳至断奶后结肠中产甲烷菌菌群的变化,对其图谱进行分析,并对其中优势条带进行了测序。DGGE图谱分析显示,断奶前后产甲烷菌群保持稳定；断奶后两周产甲烷菌条带明显增多。16S rRNA基因序列分析表明,这些条带主要属于甲烷杆菌纲和一类未知产甲烷菌。结果说明,日粮可能是影响产甲烷菌种群的主要因素。 3体外发酵法研究猪肠粪样中甲烷与乙酸生成的关系 采用体外批次培养技术,以猪粪便为接种物,研究了甲烷生成与乙酸产量间互作变化关系。试验分设对照组和处理组,BES的添加量分别为0、10、20 mM。结果表明,添加BES的浓度为20mM时,乙酸产量和丁酸显著高于对照组(P0.05)；添加BES的浓度为10mM时,乙酸产量和丁酸较对照组有所上升,但差异不显著(P0.05)。该结果揭示,添加BES可有效的抑制了甲烷的产生；抑制甲烷合成后,乙酸还原途径可能成为主要的氢利用途径。 【关键词】：猪 后肠产甲烷菌 多样性 PCR-DGGE 体外发酵
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 引言10-11
• 文献综述11-23
• 1 产甲烷菌简介11-13
• 1.1 产甲烷菌种类的多样性11
• 1.2 产甲烷菌代谢的多样性11-13
• 2 猪后肠内的甲烷菌13-16
• 2.1 猪后肠内产甲烷菌的分布14-15
• 2.2 影响猪后肠产甲烷菌多样性的可能因素15
• 2.3 甲烷菌与乙酸还原菌的关系15-16
• 3 分子生物学技术在研究产甲烷菌多样性中的应用16-18
• 3.1 16SrRNA基因序列分析技术16-17
• 3.2 RFLP分析技术17-18
• 3.3 变性梯度凝胶电泳技术18
• 4 研究目的和意义18-19
• 参考文献19-23
• 第一章 猪后肠中产甲烷菌的多样性研究23-33
• 1 材料和方法23-25
• 1.1 样品的采集23
• 1.2 主要试剂和仪器23-24
• 1.3 猪粪便总DNA提取24
• 1.4 猪粪便产甲烷古菌16SrRNA基因的扩增24
• 1.5 猪粪便产甲烷古菌16SrRNA基因的克隆、检测及测序24-25
• 1.6 序列分析及进化树建立25
• 2 结果与分析25-26
• 2.1 猪粪便产甲烷古菌16SrRNA基因的序列分析25-26
• 2.2 猪粪便产甲烷古菌系统进化分析26
• 3 讨论26-30
• 参考文献30-33
• 第二章 猪结肠中甲烷菌群多样性的时空变化规律研究33-43
• 1 材料和方法33-35
• 1.1 试验动物及采样33
• 1.2 样品总DNA的提取33-34
• 1.3 PCR反应34
• 1.4 DGGE34-35
• 1.5 序列分析及进化树建立35
• 2 结果与分析35-37
• 2.1 DGGE结果与分析35
• 2.2 猪粪便产甲烷古菌系统进化分析35-37
• 3 讨论37-40
• 参考文献40-43
• 第三章 体外发酵法研究猪肠粪样中甲烷与乙酸生成的关系43-51
• 1 材料与方法43-45
• 1.1 培养基制备和粪样的采集43-44
• 1.2 试验设计44
• 1.3 指标测定44-45
• 1.4 主要试剂和仪器45
• 1.5 数据分析45
• 2 结果与分析45-47
• 2.1 产气量比较45-46
• 2.2 甲烷产量46
• 2.3 VFA浓度的比较46-47
• 3 讨论47-49
• 参考文献49-51
• 全文结论51-53
• 附录53-63
• 致谢63

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