高PHB含量的甲烷氧化混合菌群筛选及开放培养

【摘要】：随着塑料工业的迅猛发展,环境污染问题接踵而至,为减轻塑料垃圾的危害,生物可降解塑料及其合成技术成为了人们关注的研究热点。聚p-羟基丁酸酯(PHB)是生物可降解塑料的典型代表,因其具有化学合成塑料的特性,又具有良好的生物可降解性和生物相容性等特殊性能,在塑料材料领域有着广阔的发展前景。目前,PHB生物合成路线的研究一直占据该领域的核心地位,但由于发酵成本高等因素制约,使PHB无法与石化合成塑料相竞争,难以拓宽应用市场。利用低成本高产PHB的菌株生产更具实用性的PHB对实现PHB的工业化生产有十分重要的意义,也是研究者致力研究的课题。 本论文采用好氧瞬时供料工艺即丰盛饥饿模式,以甲烷为底物开放式培养甲烷氧化混合菌群,得到高PHB含量的生长性能稳定、具有甲烷单加氧酶(Methane Monooxygenase,MMO)活性的甲烷氧化混合菌。建立了苏丹黑快速检测PHB含量的方法实现了菌群的高效筛选。对混合菌群中的微生物进行研究,平板划线分离结果表明,甲烷氧化混合菌群能利用甲烷、甲醇作为生长碳源并长势良好有MMO活性,而以乙醇、LB为碳源生长时混合菌生长状况相对良好但没有MMO活性。通过菌体间的两两交叉划线培养及分离后纯菌的PHB含量,可推测混合体系中不同的微生物协同作用,甲烷氧化菌的代谢产物被混合菌中的其它微生物构成的伴生菌充分利用,这种菌群间的协同作用有效避免了产物抑制,也有利于保持菌群结构和功能的稳定。以该混合菌为催化剂可以实现丙烯氧化生产环氧丙烷。纯种分离方法对混合菌群结构进行解析,结果表明,该混合菌群由甲烷氧化菌及其它非甲烷氧化菌组成。铜离子浓度对混合菌生长有一定影响。结合摇瓶发酵培养甲烷氧化混合菌合成PHB的研究成果,根据模拟发酵罐发酵体系自身的特点,突破两段式的传统培养方法,探索建立了一段式的短期、高效、简便的模拟发酵罐发酵培养生产PHB的方法,提高了发酵生产的效率 【关键词】：甲烷氧化混合菌 甲烷单加氧酶 苏丹黑 聚β-羟基丁酸酯(PHB) 富集 开放培养
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X172
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 1 绪论10-16
• 1.1 甲烷10
• 1.2 甲烷氧化菌10-11
• 1.3 PHB结构、性质及应用11-12
• 1.3.1 PHB的结构11-12
• 1.3.2 PHB的性质12
• 1.3.3 PHB的应用12
• 1.4 微生物生产PHB的近期发展12-15
• 1.4.1 纯菌种合成法13
• 1.4.2 混合菌种合成法13-15
• 1.5 开放式培养15
• 1.6 本课题来源、研究意义及内容15-16
• 1.6.1 课题来源、研究意义15
• 1.6.2 本课题研究内容15-16
• 2 开放条件下高PHB含量的甲烷氧化混合菌群的富集16-29
• 2.1 引言16
• 2.2 实验材料仪器16-17
• 2.2.1 实验材料16-17
• 2.2.2 主要实验仪器17
• 2.3 实验方法17-18
• 2.3.1 培养基配方17-18
• 2.3.2 丰盛阶段(feast phase)培养方法18
• 2.3.3 饥饿阶段(famine phase)培养方法18
• 2.4 分析与检测18-19
• 2.4.1 细胞生长量的测定18
• 2.4.2 PHB的定量分析18
• 2.4.3 PHB的快速检测法18-19
• 2.4.4 甲烷为碳源时细胞的生长与MMO活性19
• 2.5 结果与分析19-27
• 2.5.1 硫酸降解法测定胞内PHB的含量结果19-20
• 2.5.2 丰盛和饥饿阶段胞内PHB含量变化20
• 2.5.3 高产PHB的甲烷氧化混合菌群的富集20-23
• 2.5.4 开放条件下细胞的生长特性23
• 2.5.5 开放条件下富集的甲烷氧化菌群生长及合成PHB的稳定性23-24
• 2.5.6 不同菌种积累PHB含量的比较24-26
• 2.5.7 气相色谱测定MMO活性证明混合菌中含有甲烷氧化菌26-27
• 2.5.8 甲烷为碳源不同菌种的酶活情况27
• 2.6 本章小结27-29
• 3 甲烷氧化混合菌群的特性研究及其分离纯化29-48
• 3.1 引言29-30
• 3.2 实验材料、仪器30-31
• 3.2.1 实验材料30
• 3.2.2 实验仪器30-31
• 3.3 菌株及其培养31-32
• 3.3.1 甲烷氧化混合菌培养基的配置31
• 3.3.2 甲烷氧化混合菌的培养31-32
• 3.4 纯种分离及鉴定32-33
• 3.4.1 甲烷为碳源培养方法的建立32
• 3.4.2 固体培养基的制备32
• 3.4.3 接种固体培养基32-33
• 3.4.4 接种后固体培养基的培养33
• 3.4.5 菌种划线分离33
• 3.4.6 16S rDNA序列分析33
• 3.5 甲烷单加氧酶MMO活性测定33-34
• 3.5.1 生物量测定33
• 3.5.2 细胞生长与MMO活性33-34
• 3.6 甲烷氧化菌积累PHB的测定34
• 3.6.1 PHB的提取34
• 3.6.2 PHB含量的测定34
• 3.7 结果与讨论34-47
• 3.7.1 生长曲线34-35
• 3.7.2 MMO活性的测定35-36
• 3.7.3 丙烯生物转化生成环氧丙烷36
• 3.7.4 甲烷氧化混合菌中菌群结构的解析36-47
• 3.8 本章小结47-48
• 4 甲烷氧化混合菌发酵培养体系的建立48-55
• 4.1 引言48
• 4.2 实验器材与仪器48-50
• 4.2.1 实验材料48-49
• 4.2.2 仪器与主要试剂49
• 4.2.3 菌种来源及培养基组成49
• 4.2.4 实验设计方法49-50
• 4.3 结果与分析50-54
• 4.3.1 模拟连续发酵培养方式的细胞生长动力学与PHB积累研究50-53
• 4.3.2 一段式模拟发酵罐发酵生产PHB方法的研究53-54
• 4.4 本章小结54-55
• 结论55-57
• 参考文献57-60
• 攻读学位期间发表的学术论文60-61
• 致谢61

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