稻田甲烷排放的微生物群落结构组成及活性初步研究

【摘要】：稻田是大气甲烷排放的重要源。我国稻谷产量世界第一、水稻种植面积世界第二，稻田甲烷排放不同地区水稻土的甲烷排放有一定的差异，微生物则是稻田甲烷产生和氧化的生物源，研究我国稻田甲烷排放的微生物机制具有重要意义。本论文针对我国典型稻田土壤，围绕稻田甲烷产生和甲烷氧化过程，采用微生物分子生态学方法，如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量(qPCR)、变性梯度凝胶电泳分子指纹图谱(DGGE)、克隆文库和稳定性同位素核酸探针等技术，研究了长期氮肥施用以及大气CO_2浓度升高下稻田土壤产甲烷古菌的丰度和群落结构变化规律，进一步研究了三种典型稻田土壤甲烷氧化动力学规律及其微生物作用者，主要研究结果如下： 1、长期施用（22年）无机有机混合肥（NPK/OM）导致产甲烷古菌数量增加，并可能促进甲烷八叠球菌的生长，但产甲烷古菌整体微生物群落组成变化较小。长期单独施用无机氮肥对产甲烷古菌群落结构影响较小。 2、大气CO_2浓度升高（FACE）促进水稻分蘖期产甲烷古菌数量的增加，在2009年分蘖期非根际土壤中达到了显著性水平，而对扬花期、拔节期和灌浆期的产甲烷古菌丰度有一定的抑制作用。与根际土壤相比，非根际土壤受到的抑制作用较小。此外，与施用低氮肥相比较，施用高氮肥在一定程度降低了土壤产甲烷古菌的数量。 3、低甲烷初始浓度（700ug·L~(-1)）条件下，广东雷州稻田土壤的甲烷氧化速率最小，湖南古市稻田土壤和湖南桃源稻田土壤的甲烷氧化速率较为一致；高浓度甲烷（7000ug·L~(-1)）条件下，湖南古市稻田土壤的甲烷氧化速率最大，广东雷州和湖南桃源的稻田土壤甲烷氧化速率较为一致。进一步采用稳定性同位素13C示踪稻田土壤中甲烷氧化细菌的核酸DNA结果表明三种稻田土壤中活性甲烷氧化细菌种类不同，湖南古市稻田土壤中类型Ⅰ甲烷氧化细菌占所有甲烷氧化细菌的77.8%（克隆文库数据）；湖南桃源稻田土壤中类型Ⅱ型甲烷氧化细菌占所有克隆序列的80%；类型I甲烷氧化细菌主导了广东雷州稻田土壤甲烷氧化。结果表明类型I和类型II甲烷氧化细菌的活性具有一定差异，是稻田土壤甲烷氧化能力空间变异的重要因子。 总之，尽管水稻土中产甲烷古菌微生物群落组成较为稳定，但有机无机氮肥混合施用、大气CO_2浓度升高可能增加稻田土壤产甲烷古菌的数量。典型稻田土壤的甲烷氧化动力学过程及其甲烷氧化微生物作用者具有一定的地理分布规律。 【关键词】：施肥 FACE 产甲烷古菌 甲烷氧化细菌 稳定性同位素核酸探针
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：S511;S181
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 1 文献综述8-17
• 1.1 产甲烷古菌的生理学与系统发育史的研究进展8-10
• 1.1.1 稻田产甲烷古菌的分类及多样性8-9
• 1.1.2 稻田产甲烷古菌的代谢与系统发育的关系9-10
• 1.2 甲烷氧化细菌的生理学与系统发育史的研究进展10-11
• 1.2.1 稻田甲烷氧化细菌的分类及多样性10-11
• 1.2.2 稻田甲烷氧化细菌的代谢与系统发育的关系11
• 1.3 影响稻田甲烷排放因素的研究进展11-13
• 1.3.1 土壤性质对稻田甲烷排放的影响11-12
• 1.3.1.1 土壤氧化还原电位（Eh）11
• 1.3.1.2 土壤有机质11-12
• 1.3.1.3 土壤温度12
• 1.3.1.4 土壤的其他理化性质12
• 1.3.2 耕作管理对稻田甲烷排放的影响12-13
• 1.3.2.1 排水管理12-13
• 1.3.2.2 施肥13
• 1.3.3 植物对稻田甲烷排放的影响13
• 1.4 稻田甲烷排放相关微生物的生态学方法13-17
• 1.4.1 稳定性同位素核酸探针技术13-14
• 1.4.2 分子指纹图谱分析技术（PCR-DGGE）14-15
• 1.4.3 实时荧光定量 PCR 技术（qPCR）15-17
• 2 引言17-19
• 3 材料与方法19-29
• 3.1 实验材料19-20
• 3.1.1 长期施肥处理的土壤样品采集19
• 3.1.2 FACE 处理的土壤样品采集19-20
• 3.1.2.1 样地概况19
• 3.1.2.2 土样采集19-20
• 3.1.3 三种典型稻田土壤样品采集20
• 3.2 实验设计20-21
• 3.3 主要试剂与仪器21-22
• 3.3.1 土壤微生物基因组 DNA 提取21
• 3.3.2 荧光实时定量 PCR21
• 3.3.3 分子指纹图谱分析 DGGE21
• 3.3.4 克隆21
• 3.3.5 甲烷氧化培养实验21
• 3.3.6 超高速密度梯度离心及分层实验21
• 3.3.7 其他试剂与设备21-22
• 3.4 测定项目与方法22-29
• 3.4.1 土壤理化性质的测定22
• 3.4.1.1 全氮、全碳的测定22
• 3.4.1.2 硝态氮、铵态氮的测定22
• 3.4.1.3 pH 的测定22
• 3.4.1.4 有机质的测定22
• 3.4.1.5 含水量的测定22
• 3.4.1.6 最大持水量的测定22
• 3.4.2 土壤微生物基因组 DNA 提取22-23
• 3.4.3 土壤产甲烷古菌和甲烷氧化细菌的定量分析23-24
• 3.4.3.1 土壤产甲烷古菌的定量分析23-24
• 3.4.3.2 土壤甲烷氧化细菌的定量分析24
• 3.4.4 土壤产甲烷古菌群落的分子指纹图谱分析24-25
• 3.4.4.1 产甲烷古菌 16S rRNA 基因的 PCR24
• 3.4.4.2 DGGE24
• 3.4.4.3 克隆测序以及基因序列比对24-25
• 3.4.5 三种典型稻田土壤甲烷氧化的预培养25-26
• 3.4.6 三种典型稻田土壤甲烷氧化菌的13C 标记培养26
• 3.4.7 超高速密度梯度离心及分层26-28
• 3.4.8 构建13C-DNA 的 pmoA 基因克隆文库28-29
• 4 结果与分析29-41
• 4.1 不同施肥模式对稻田土壤产甲烷古菌群落结构的影响29-32
• 4.1.1 长期不同施肥模式对土壤基本属性的影响29
• 4.1.2 长期不同施肥模式对产甲烷古菌功能基因 mcrA 数量的影响29-30
• 4.1.3 长期不同施肥模式对产甲烷古菌组成的影响30-32
• 4.2 未来大气 CO_2升高（FACE）下稻田土壤产甲烷古菌丰度的变化规律32-34
• 4.2.1 FACE 处理对产甲烷古菌数量的影响32-33
• 4.2.2 FACE 处理下产甲烷古菌的年际变化规律33-34
• 4.3 三种典型稻田土壤的甲烷氧化动力学规律及其微生物作用者34-41
• 4.3.1 土壤样品的理化性质34-35
• 4.3.2 典型稻田土壤甲烷氧化过程的动力学变化规律35-36
• 4.3.3 三种典型稻田土壤样品的13CH4标记36-37
• 4.3.4 超高速密度梯度离心分层样品的 pmoA 定量分析37
• 4.3.5 甲烷氧化细菌功能基因的系统发育树分析37-41
• 5 讨论41-44
• 5.1 长期施肥处理后产甲烷古菌丰度及群落结构的变化41
• 5.2 FACE 处理与氮肥施用量相互作用后产甲烷古菌丰度的变化41-42
• 5.3 三种典型稻田土壤中甲烷氧化细菌的活性及群落组成的差异42-44
• 6 结论44-45
• 7 参考文献45-51
• 附录51-52
• 作者简介52-53
• 致谢53

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