乙酸和硫酸盐对石油烃降解产甲烷过程影响的研究

【摘要】：本实验以15℃、35℃和55℃三种不同温度的厌氧烃降解富集物为接种物，通过添加抑制乙酸营养型产甲烷菌生长的抑制剂NH4Cl和CH3F，探究在这三个温度的烃降解富集物中是否存在乙酸互营氧化过程。以35℃烃降解富集物为接种物探究不同浓度的硫酸盐对正十六烷的厌氧降解的影响。采用不同的提取方法提取DNA、采用不同的缓冲液维持pH，研究这些不同的处理手段对富集物中的群落结构是否造成影响。 研究结果如下：（1）五种方法得到的细菌和古菌的群落结构的组成比较相似，说明这几种提取方法对群落结构的组成影响不大，但是对某些片段的相对丰度会有一些影响。（2）发现PB组的乙酸降解产甲烷延滞期约40天，显著高于添加其他组的20-24天（p 0.05）；添加NaHCO3/CO2组的乙酸降解转化为甲烷的比例为88.3±0.5%，显著高于其他组的77-81%（p 0.05）；添加不同缓冲液组中的最大甲烷比生长速率都在0.46-0.57d-1（p0.05）；添加NaHCO3/CO2的细菌群落变化明显，主要是一类未培养细菌（unclassified bacteria）、Spirochaetaceae科细菌和未培养WWE1类群的丰度分别增加到15.5±9.4%、7.3±4.6%和17.6±6.3%，而Synergistaceae科的细菌丰度降低到8.9±8.1%。AC+PB组中的古菌类群发生了明显变化，由Methanosaeta harundinacea相关的产甲烷古菌占主导（97±2%），而在添加HEPES、PIPES和NaHCO3和不加缓冲液组中同时存在两个种的氢营养型产甲烷古菌Methanosaeta harundinacea和Methanosaeta concilii，以及属于Methanobacteriales的氢营养型产甲烷古菌。（3）实验室富集的低温、中温和高温正十六烷烃降解产甲烷菌系Y15、M82和SK都可以利用乙酸生长，但是添加乙酸营养型产甲烷古菌的抑制剂NH4Cl和CH3F，Y15几乎全由Methanosaeta组成；M82的群落结构未发生显著变化，主要由Methanosaeta和Methanoculleus组成；而SK的古菌群落从Methanosaeta为主演替为Methanthermobacter为主。这些研究表明高温石油烃降解产甲烷过程中可能存在乙酸互营氧化产甲烷代谢过程。（4）发现中温产甲烷菌系M82可以在硫酸盐浓度为0.5-25mM条件下降解正十六烷烃产生甲烷，当硫酸盐浓度达到15-25mM，甲烷产生速率与甲烷产量显著降低。分析群落结构，发现不同硫酸盐浓度条件下，细菌群落结构并没有发生显著变化，而0.5-10mM硫酸盐条件下，古菌群落结构相似，优势片段是T-RF495bp，而在15-25mM硫酸盐条件下，优势片段逐渐演替为186bp。中间代谢产物GC-MS分析发现Hex在M82菌系中降解途径和SO42-的浓度关系不大，这种代谢途径有可能是一种新的代谢途径。 【关键词】：乙酸互营氧化 产甲烷作用 硫酸盐 正十六烷烃 群落结构
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：TQ221.11;Q939.9
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-15
• 英文缩略表15-16
• 第一章 绪论16-23
• 1.1 研究背景16
• 1.2 研究目的和意义16
• 1.2.1 石油烃降解产甲烷过程中的乙酸降解产甲烷途径研究16
• 1.2.2 硫酸盐胁迫下石油烃降解产甲烷菌群的响应机制研究16
• 1.3 国内外研究现状16-23
• 1.3.1 乙酸互营氧化途径的研究17-20
• 1.3.2 硫酸盐对厌氧发酵的影响20-23
• 第二章 石油烃降解产甲烷菌系 DNA 提取方法比较研究23-30
• 2.1 实验目的23
• 2.2 实验材料23-24
• 2.2.1 样品富集物来源23
• 2.2.2 主要试验仪器和试剂23-24
• 2.3 实验方法24-25
• 2.3.1 DNA 的提取及纯化24
• 2.3.2 PCR 及产物纯化24-25
• 2.3.3 酶切及产物纯化25
• 2.3.4 T-RFLP 分析25
• 2.3.5 统计分析25
• 2.4 实验结果25-28
• 2.4.1 DNA 浓度的测定结果25-26
• 2.4.2 群落结构26-28
• 2.5 讨论与结论28-30
• 第三章 不同 pH 缓冲液对乙酸降解产甲烷菌群结构的影响30-38
• 3.1 实验目的30
• 3.2 材料与方法30-31
• 3.2.1 富集培养30-31
• 3.2.2 实验方案31
• 3.3 分析方法31-33
• 3.3.1 气体组分分析31-32
• 3.3.2 VFA 分析32
• 3.3.3 DNA 提取及纯化32
• 3.3.4 PCR 及产物纯化32
• 3.3.5 酶切及产物纯化32
• 3.3.6 T-RFLP 分析32
• 3.3.7 统计分析32-33
• 3.4 结果与分析33-37
• 3.4.1 不同缓冲液中的乙酸降解产甲烷趋势33-34
• 3.4.2 T-RFLP 结果分析34-37
• 3.5 讨论与结论37-38
• 第四章 石油烃降解产甲烷过程中乙酸降解产甲烷途径研究38-54
• 4.1 实验目的38
• 4.2 材料与方法38-39
• 4.2.1 试验材料38
• 4.2.2 富集培养38
• 4.2.3 实验方案38-39
• 4.3 分析方法39-41
• 4.3.1 气体组分分析39
• 4.3.2 VFA 分析39-40
• 4.3.3 DNA 提取及纯化40
• 4.3.4 PCR 及产物纯化40
• 4.3.5 酶切及产物纯化40
• 4.3.6 T-RFLP 分析40
• 4.3.7 16S 克隆文库的构建及测序分析40-41
• 4.3.8 统计分析41
• 4.4 结果与分析41-52
• 4.4.1 乙酸降解产甲烷途径产气趋势图41-44
• 4.4.2 群落结构结果分析44-52
• 4.5 讨论与结论52-54
• 第五章 硫酸盐胁迫下烃降解产甲烷富集物的应答54-64
• 5.1 实验目的54
• 5.2 材料与方法54-55
• 5.2.1 试验材料54
• 5.2.2 富集培养54
• 5.2.3 实验方案54-55
• 5.3 分析方法55-57
• 5.3.1 气体组分分析55
• 5.3.2 VFA 分析55
• 5.3.3 DNA 提取及纯化55
• 5.3.4 PCR 及产物纯化55
• 5.3.5 酶切及产物纯化55
• 5.3.6 T-RFLP 分析55
• 5.3.7 16S 克隆文库的构建及测序分析55
• 5.3.8 GC-MS 代谢产物分析55-56
• 5.3.9 硫酸根浓度的测定56
• 5.3.10 统计分析56-57
• 5.4 结果与分析57-62
• 5.4.1 不同浓度硫酸盐胁迫下的产气趋势图57-58
• 5.4.2 硫酸根浓度的测定58
• 5.4.3 GC-MS 代谢产物图谱58-60
• 5.4.4 群落结构分析60-62
• 5.5 讨论与结论62-64
• 第六章 结论、工作不足与展望64-66
• 6.1 结论64-65
• 6.1.1 发现不同提取方法对乙酸降解产甲烷菌群结构影响的差异性64
• 6.1.2 发现不同 pH 缓冲剂对乙酸降解产甲烷菌群结构的影响不同64
• 6.1.3 发现了不同温度下的石油烃降解产甲烷途径不同64-65
• 6.1.4 发现硫酸盐胁迫下石油烃降解产甲烷菌群的响应机制65
• 6.2 工作不足与展望65-66
• 6.2.1 不同 pH 缓冲液对乙酸降解产甲烷菌群结构的影响65
• 6.2.2 石油烃降解产甲烷过程中的乙酸降解产甲烷途径研究65
• 6.2.3 硫酸盐胁迫下烃降解产甲烷富集物的应答65-66
• 参考文献66-78
• 致谢78-80
• 个人简历80

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