孔雀石绿降解菌的分离鉴定、生物学特性研究及三苯甲烷还原酶基因的克隆和表达

【摘要】：从某化工厂污水处理池的活性污泥中分离筛选到两株孔雀石绿降解细菌,经形态、生理生化特性测定及16S rRNA基因相似性比较,将它们初步鉴定为Raoultella sp.K4-W (GenBank Accession No. EU876828)和Pseudomonas sp.K9 (GenBank Accession No. EU855781)。 菌株K4-W在pH5.0-10.0范围内生长良好,最适生长pH为7.0,最适生长温度为30℃,木糖为其最适生长碳源,蛋白胨为其最适生长氮源；K9在pH为6.0-10.0的范围内生长良好,最适生长pH为7.0,最适生长温度也为30℃,麦芽糖为其最适生长碳源,牛肉膏为其最适生长氮源。 在含有20mg·L1的孔雀石绿的无机盐培养基中,K4-W和K9在48h内对其的降解率分别为82.5%和88.3%。K4-W和K9对孔雀石绿的最适降解温度为30℃。高于20mg·L1的孔雀石绿起始浓度会降低两株菌的降解率,除Pb2+(0.5mmol·L-1)有促进作用外,A13+、Mn2+和Zn2+等都会抑制K4-W对孔雀石绿的降解。K9的降解能力却会受Cd2+、Mn2+和Mg2+等所有供试金属离子的抑制。K4-W只能降解孔雀石绿,对其他三苯甲烷类染料无降解功能；K9除了能降解孔雀石绿以外还能降解结晶紫及碱性品红等三苯甲烷类染料。 根据已报道的三苯甲烷还原酶基因(tmr2)设计引物,从K9和K4-W扩增该基因。结果显示,从K9中能扩增到tmr2基因(864bp),通过在线比对序列相似性,该基因与Pseudomonas stutzeri MDB-1中的tmr2(GenBank accession No.EF463103)相似性高达100%,与Citrobacter sp.MY-5中的tmr(GenBank accession No.AY756172)和Aeromonas hydrophila DN322中的tmpD(GenBank accession No.EF010984)相似性为99%。但未从K4-W中扩增到该基因,该菌株是否含有新的三苯甲烷还原酶基因,还需进一步研究。将tmr2基因构建到表达载体pET29a中,转化到E.coli BL21(DE3)中进行了表达,得到了分子量符合预期大小的蛋白质(31KD),该蛋白具有三苯甲烷还原酶活性,它能够依赖辅酶NADH还原孔雀石绿,结晶紫和碱性品红。该特性与前人报道的从Citrobacter sp. MY-5和Pseudomonas stutzeri MDB-1克隆到的tmr基因在E.coli BL21(DE3)中表达产物的特性一致。通过染色体步移(chromosome walking),获得了tmr2基因上游和下游片段,它们和tmr2基因拼接后的总长为5946bp。对其进行分析,在上游片段中没有发现有意阅读框,下游片段包含了一个典型的移动元件ISPpu12,该移动元件由tnpA(编码转座酶),IspA(编码脂蛋白信号肽酶)和orfl(编码CDF家族重金属离子/H+外排通道蛋白)组成。据此推测tmr基因可能是一个可以在菌株之间进行水平转移的基因,但还需要进一步研究来证明。 【关键词】：孔雀石绿 微生物降解 三苯甲烷还原酶基因克隆 移动元件
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：X172
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 符号与缩略语说明11-12
• 前言12-13
• 第一章 文献综述13-27
• 第一节 三苯甲烷类染料及孔雀石绿简介13-18
• 1 三苯甲烷类染料概述13-14
• 2 三苯甲烷类染料污染及危害14-15
• 3 孔雀石绿的结构、性质及用途15-16
• 4 孔雀石绿的危害16-17
• 5 孔雀石绿及关联产物的检测17-18
• 5.1 分光光度法17
• 5.2 高效液相色谱法17-18
• 5.3 高效液相色谱-质谱法18
• 第二节 三苯甲烷类染料及孔雀石绿的降解研究进展18-22
• 1 吸附法18-19
• 2 光催化氧化19-20
• 3 生物法20-21
• 3.1 具有降解脱色能力的真菌20
• 3.2 具有降解脱色能力的细菌20-21
• 3.3 降解脱色混合菌21
• 4 微生物降解三苯甲烷类染料的展望21-22
• 参考文献22-27
• 第二章 孔雀石绿降解菌的分离、鉴定及其降解特性研究27-49
• 第一节 孔雀石绿降解菌株K4-W和K9的分离与鉴定27-41
• 1 材料与方法27-29
• 1.1 培养基与试剂27
• 1.2 孔雀石绿降解菌的分离27-28
• 1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定28
• 1.4 降解菌株16S rRNA基因序列的测定28-29
• 1.5 降解菌株系统发育地位的确定29
• 1.6 菌体生长量的测定29
• 1.7 孔雀石绿的含量测定29
• 2 结果与讨论29-40
• 2.1 孔雀石绿降解菌株的分离29-30
• 2.2 降解菌株K4-W和K9的菌落形态及生理生化特征30-31
• 2.3 菌株K4-W和K9的16S rRNA基因扩增31-32
• 2.4 降解菌株K4-W和K9的鉴定结果32-34
• 2.5 环境条件对降解菌株K4-W和K9生长的影响34-39
• 2.6 菌株K4-W和K9对抗生素的耐受性39-40
• 3 小结40-41
• 第二节 孔雀石绿降解菌株K4-W和K9的降解特性研究41-47
• 1 材料与方法41
• 1.1 培养基与试剂41
• 1.2 菌体生长量的测定41
• 1.3 孔雀石绿及其他染料的含量测定41
• 1.4 种子液培养41
• 2 结果与讨论41-47
• 2.1 菌株K4-W和K9的生长和孔雀石绿降解的关系41-42
• 2.2 孔雀石绿起始浓度对K4-W和K9降解孔雀石绿的影响42-43
• 2.3 温度对K4-W和K9降解孔雀石绿的影响43-44
• 2.4 接种量对K4-W和K9降解孔雀石绿的影响44-45
• 2.5 金属离子对K4.W和K9降解孔雀石绿的影响45-46
• 2.6 K4-W和K9对不同染料的降解情况46-47
• 3 小结47
• 参考文献47-49
• 第三章 三苯甲烷还原酶基因(tmr2)的克隆及表达49-63
• 1 材料和方法49-54
• 1.1 培养基与试剂49
• 1.2 菌株与质粒49-50
• 1.3 菌体基因组DNA的提取50
• 1.4 质粒DNA的小量提取50-51
• 1.5 普通感受态细胞的制备(CaCl_2法)51
• 1.6 三苯甲烷还原酶基因的引物设计和PCR扩增51-52
• 1.7 PCR产物的纯化及酶切52
• 1.8 表达载体pET29a的制备52
• 1.9 酶连及酶连产物的转化52-53
• 1.10 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析53
• 1.11 酶活分析53-54
• 2 结果与讨论54-60
• 2.1 PCR法克隆三苯甲烷还原酶基因54-55
• 2.2 序列测定与比较分析55
• 2.3 tmr2基因在E.coli BL21(DE3)中的表达55-60
• 3 小结60
• 参考文献60-63
• 第四章 三苯甲烷还原酶基因(tmr2)的侧翼序列扩增及分析63-69
• 1 材料与方法63-65
• 1.1 培养基与试剂63
• 1.2 菌株与质粒63
• 1.3 菌体基因组DNA和质粒DNA的提取63-64
• 1.4 侧翼序列SEFA-PCR引物设计和PCR扩增64-65
• 1.5 PCR产物的TA克隆65
• 1.6 序列分析65
• 2 结果与讨论65-66
• 2.1 tmr2基因侧翼序列的扩增及分析65-66
• 3 小结66-67
• 参考文献67-69
• 全文总结69-71
• 附录一 文中所用培养基及试剂配方71-73
• 附录二 相关DNA序列73-79
• 攻读硕士学位期间发表或已接收的论文79-81
• 致谢81

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