甲烷蛋白的制备及核酸去除

【摘要】：甲烷氧化菌是可以利用甲烷作为唯一碳源进行生长的革兰氏阴性细菌,是生产甲烷单细胞蛋白的主要菌体。甲烷作为制备甲烷单细胞蛋白(甲烷蛋白)的碳源,是碳的完全还原形式,没有产生直接毒性的问题,不含致癌的稠环芳烃等杂质,在发酵工艺过程中也不需要昂贵的提纯设备,国内对甲烷蛋白的研究仍处在试验阶段。本论文主要研究了几种生长因素对甲基弯菌Methylosinus trichosporium IMV3011生长的影响以及过量核酸的去除并确立一种简单有效的核酸去除方法。为利用甲烷氧化菌生产甲烷单细胞蛋白奠定基础。 本实验的研究内容包括： 根据甲烷氧化菌利用碳源的特殊性对甲基弯菌IMV3011在间歇发酵中进行开放式培养,并与封闭式环境下培养的IMV3011在菌体生长曲线以及MMO酶活性方面进行比较,验证了其在非灭菌的情况下也能正常生长。 采用每日更换新鲜培养基的方法对IMV3011进行半连续培养,分析菌体生长哪个阶段更适于补加新鲜培养基,确定一种较优的培养方式。验证得出培养IMV3011时可以在48h后进行新鲜培养基的补料和添加,这样有助于一些对其生长起正向作用的代谢产物的积累,有利于工业化生产。 不同外源因子对甲烷氧化菌生长的影响。分别考察了D-生物素、叶酸、核黄素、维生素B12等生长因子对IMV3011生长的影响,并对不同生长因子的添加对菌体生长的影响进行了比较。结果表明：未添加外源因子时,菌体生长延滞期为62.5h,发酵终止后干重为0.31gdwcL-1。D-生物素添加量为1Oug/L时,延滞期缩短到5.8h,发酵终止后的干重为0.29gdwcL-1,与未添加时相比大大缩短了延滞期的时间但干重有所下降。叶酸添加量为5ug/L时,延滞期最短,缩短到3.2h,发酵终止后的干重为0.97gdwcL-1是未添加时的3倍。核黄素添加量为5ug/L时,延滞期缩短到15.1h,发酵终止后的干重为0.77gdwcL-1,是未添加时的2.5倍。维生素B12添加量为0.5ug/L时,延滞期为18.7h,发酵终止后的干重为0.84gdwcL-1,是未添加时的2.7倍。 研究了超声波法、浓盐法、浓盐与超声波破碎结合法、菌体自溶法等四种处理方法对菌体中核酸的脱除效果。通过比较得出菌体自溶法是去核酸的最优方法。研究了温度、菌体浓度、处理时间、体系pH值等四种因素对菌体自溶法脱除核酸效果的影响。通过菌体自溶法的单因素实验和正交实验,确定了最优实验方案,得出IMV3011中过量核酸的脱除的最佳条件为：温度70℃,菌体浓度0.9%(湿重),处理时间50min,体系pH值10。在此最佳条件下核酸脱除量最大值为44.75ug/mL,以菌体内核酸含量占菌体干重的9.9%计算,脱除率为50.2%。 【关键词】：甲烷氧化菌 单细胞蛋白 发酵方式 去核酸
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：TQ936
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 1 绪论11-20
• 1.1 单细胞蛋白11-12
• 1.1.1 单细胞蛋白的概念11
• 1.1.2 单细胞蛋白的营养价值11-12
• 1.1.3 生产单细胞蛋白的菌种选择12
• 1.1.4 生产单细胞蛋白的原料12
• 1.2 甲烷氧化菌12-14
• 1.2.1 甲烷氧化菌的概念及分类12-13
• 1.2.2 甲烷氧化菌的碳代谢途径13-14
• 1.2.3 甲烷单加氧酶14
• 1.3 甲烷氧化菌单细胞蛋白14-18
• 1.3.1 特点和营养价值14-16
• 1.3.2 甲烷氧化菌制备单细胞蛋白的研究状况16-18
• 1.4 工业生产发酵方式18
• 1.5 本课题来源及研究意义18-19
• 1.5.1 课题来源18
• 1.5.2 研究意义18-19
• 1.6 论文的研究内容19-20
• 2 甲烷氧化菌的开放培养20-29
• 2.1 引言20
• 2.2 实验仪器与材料20-22
• 2.2.1 实验仪器20-21
• 2.2.2 实验材料21
• 2.2.3 实验菌种21-22
• 2.3 实验方法22-24
• 2.3.1 甲烷氧化菌无机盐培养基的配制22
• 2.3.2 甲烷氧化菌的培养22-23
• 2.3.3 甲烷氧化菌单加氧酶酶活测定23
• 2.3.4 生物量测定及数据分析23-24
• 2.4 结果与分析24-28
• 2.4.1 环氧丙烷标准曲线的确立24-25
• 2.4.2 复壮前后的对比25-26
• 2.4.3 两种培养方式对IMV3011生长的影响26-28
• 2.5 本章小结28-29
• 3 两种发酵方式对甲烷氧化菌生长的影响29-37
• 3.1 引言29
• 3.2 实验仪器与材料29-31
• 3.2.1 实验仪器29-30
• 3.2.2 实验材料30
• 3.2.3 实验菌种30-31
• 3.3 实验方法31-32
• 3.3.1 甲烷氧化菌无机盐培养基的配制31
• 3.3.2 甲烷氧化菌的培养31
• 3.3.3 甲烷氧化菌单加氧酶酶活的测定31
• 3.3.4 生物量测定及数据分析31-32
• 3.4 结果与分析32-36
• 3.4.1 Ⅰ组中两种培养方式对IMV3011生长的影响32-34
• 3.4.2 Ⅱ组中两种培养方式对IMV3011生长的影响34-36
• 3.5 本章小结36-37
• 4 生长因子对甲烷氧化菌生长的影响37-49
• 4.1 引言37
• 4.2 实验仪器与器材37-38
• 4.2.1 实验仪器37-38
• 4.2.2 实验材料38
• 4.2.3 实验菌种38
• 4.3 实验方法38-39
• 4.3.1 甲烷氧化菌无机盐培养基的配制38
• 4.3.2 甲烷氧化菌的培养38-39
• 4.3.3 确定生长因子最适添加量39
• 4.3.4 生长因子对菌体生长状况的影响39
• 4.3.5 生物量测定及数据分析39
• 4.4 结果与分析39-48
• 4.4.1 生长因子最适添加量的确定39-44
• 4.4.2 生长因子对菌体生长状况的影响44-48
• 4.5 本章小结48-49
• 5 甲烷氧化菌中过量核酸的去除49-61
• 5.1 引言49
• 5.2 实验仪器与材料49-51
• 5.2.1 实验仪器49-50
• 5.2.2 实验材料50-51
• 5.2.3 实验菌种51
• 5.3 实验方法51-55
• 5.3.1 甲烷氧化菌无机盐培养基的配制51
• 5.3.2 甲醇为碳源的菌种培养51
• 5.3.3 核酸脱除方法的比较51-53
• 5.3.4 菌体自溶法单因素优化实验53
• 5.3.5 菌体自溶法正交实验53-54
• 5.3.6 确定最优核酸脱除方法54
• 5.3.7 核酸脱除量的测定方法54-55
• 5.4 结果与分析55-60
• 5.4.1 浓盐法、超声波破碎法、菌体自溶法及浓盐和超声波破碎结合法的比较55-56
• 5.4.2 菌体自溶法单因素试验56-59
• 5.4.3 菌体自溶法最优实验方案的确定59-60
• 5.5 本章小结60-61
• 结论61-62
• 参考文献62-66
• 附录166-68
• 附录268-69
• 攻读学位期间发表的学术论文69-70
• 致谢70

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