低剂量3,3’-二吲哚甲烷通过调控Wnt4自分泌促进胃癌进展

【摘要】：目的:3,3’-二吲哚甲烷(DIM)对癌症的治疗作用已被证实,但不同剂量的DIM对胃癌是否有不同作用尚不清楚,本研究旨在探讨低剂量的抗肿瘤药物DIM对胃癌细胞增殖、迁移及肿瘤干细胞特性的影响及作用机制,为揭示低剂量DIM在胃癌中的作用提供实验证据,同时也为DIM更好的应用临床提供新的实验依据和方法。方法:应用平板克隆形成实验分析低剂量的DIM对胃癌细胞增殖的影响,采用Western blot和免疫荧光检测低剂量的DIM作用胃癌细胞后增殖、迁移和干性相关蛋白及信号通路蛋白表达的变化情况。通过划痕实验和Transwell迁移实验检测低剂量的DIM对胃癌细胞迁移能力的影响。成脂诱导实验分析低剂量的DIM对胃癌细胞成脂分化潜能的影响。联合β-catenin通路抑制剂ICG001预处理,通过平板克隆形成实验、Western blot和成脂诱导实验验证低剂量的DIM是否通过活化β-catenin信号通路促进胃癌细胞增殖、迁移和增强其干性及分化潜能。采用TOP/FOP Flash荧光虫素酶报告基因检测低剂量的DIM对Wnt/β-catenin信号通路的活化情况。构建和包装PORCN、WNT4以及GFP对照慢病毒shRNA,并转染和筛选HGC-27稳定细胞株。运用q RT-PCR和Western blot检测PORCN、WNT4的敲减效率,通过平板克隆形成实验、Western blot、免疫荧光和成脂诱导实验评价低剂量的DIM对PORCN、WNT4敲减后的HGC-27细胞增殖、迁移、干性及分化潜能的影响。采用裸鼠皮下致瘤模型研究低剂量的DIM对胃癌细胞体内致瘤能力的影响,qRT-PCR检测瘤组织中Snail和N-cadherin的表达,免疫组化和免疫荧光检测瘤组织中Wnt4、β-catenin和CD44的表达。结果:体外实验结果显示高剂量的DIM显著抑制胃癌细胞增殖,而低剂量的DIM能促进胃癌细胞增殖蛋白PCNA和Cyclin-D3的表达、迁移相关蛋白N-cadherin、Vimentin的上调和E-cadherin的下调,增强其干性蛋白CD44、Sall4、Oct4、Cmyc和Sox2的表达。研究显示低剂量的DIM对胃癌细胞增殖、迁移和干性的促进作用与Wnt/β-catenin信号通路的活化有关,且该作用可被β-catenin抑制剂ICG001所逆转;干扰WNT分子自分泌后,DIM的这种作用即可逆转,证明低剂量的DIM可能通过促进WNT分子自分泌促进胃癌干性及进展;筛检HGC-27细胞中WNT分子的表达发现WNT4明显上调,将其敲减后,低剂量的DIM对胃癌细胞的促增殖、促迁移、干性上调作用明显减弱。裸鼠皮下致瘤实验表明,低剂量的DIM预处理的胃癌细胞体内致瘤能力明显增强。免疫组化、免疫荧光结果显示低剂量DIM作用组瘤组织中Wnt4、β-catenin和CD44表达都明显增强。结论:低剂量的DIM通过诱导Wnt4自分泌途径活化β-catnin信号通路促进胃癌细胞增殖、迁移并增强其干性,促进体内胃癌的发展。 【关键词】：胃癌 3 3’-二吲哚甲烷 自分泌 Wnt4 β-catenin
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 英文缩略词中英文注释表15-17
• 第一章 绪论17-23
• 1.1 胃癌17-18
• 1.1.1 EMT与肿瘤转移17
• 1.1.2 肿瘤干性与肿瘤形成17-18
• 1.2 3,3′-diindolylmethane（DIM）与胃癌18-20
• 1.2.1 DIM生物学特性18-19
• 1.2.2 DIM的抗肿瘤作用及机制19
• 1.2.3 低剂量的DIM对肿瘤的作用及机制19-20
• 1.2.4 小分子药物与细胞再编程20
• 1.3 Wnt/β-catenin信号通路与胃癌20-23
• 1.3.1 Wnt/β-catenin信号通路20-21
• 1.3.2 PORCN基因：Wnts分子脂质修饰的关键21
• 1.3.3 Wnt/β-catenin与EMT和肿瘤干性21
• 1.3.4 Wnt/β-catenin与胃癌21-23
• 第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义23-27
• 2.1 研究目的23
• 2.2 研究方法23-24
• 2.3 实验设计方案24-26
• 2.4 研究意义26-27
• 第三章 低剂量的DIM对胃癌细胞增殖、迁移及干性调节的影响27-40
• 3.1 材料27-29
• 3.1.1 细胞株27
• 3.1.2 主要试剂27-28
• 3.1.3 主要仪器及相关耗材28-29
• 3.2 方法29-32
• 3.2.1 细胞培养29
• 3.2.2 平板克隆形成实验29
• 3.2.3 细胞蛋白的提取29
• 3.2.4 Western blot29-30
• 3.2.5 划痕实验30
• 3.2.6 Transwell迁移实验30-31
• 3.2.7 细胞免疫荧光31
• 3.2.8 成脂诱导培养31
• 3.2.9 统计分析31-32
• 3.3 结果32-38
• 3.3.1 低剂量的DIM促进胃癌细胞克隆集落形成32-33
• 3.3.2 低剂量的DIM上调胃癌细胞增殖相关蛋白的表达33-34
• 3.3.3 低剂量的DIM促进胃癌细胞迁移34-35
• 3.3.4 低剂量的DIM促进胃癌细胞EMT的发生35-36
• 3.3.5 低剂量的DIM增强胃癌细胞干性和分化能力36-38
• 3.4 讨论38-40
• 第四章 低剂量的DIM通过活化Wnt/β-catenin信号通路促进胃癌进展40-48
• 4.1 材料40-41
• 4.1.1 细胞株40
• 4.1.2 主要试剂40
• 4.1.3 主要仪器及相关耗材40-41
• 4.2 方法41-42
• 4.2.1 细胞蛋白的提取和Western blot41
• 4.2.2 细胞免疫荧光41
• 4.2.3 平板克隆形成实验41
• 4.2.4 成脂诱导实验41
• 4.2.5 上清的收集41-42
• 4.2.6 荧光虫素酶双报告基因检测42
• 4.2.7 上清作用细胞42
• 4.3 结果42-46
• 4.3.1 低剂量的DIM活化 β-catenin42-43
• 4.3.2 β-catenin通路抑制剂ICG001可以逆转低剂量的DIM对胃癌细胞的影响43-45
• 4.3.3 低剂量的DIM活化Wnt/β-catenin信号通路45-46
• 4.4 讨论46-48
• 第五章 低剂量的DIM通过促进HGC-27细胞Wnt4的自分泌活化 β-catenin信号通路48-63
• 5.1 材料48-50
• 5.1.1 细胞株48
• 5.1.2 主要试剂48-50
• 5.1.3 主要仪器及相关耗材50
• 5.2 方法50-54
• 5.2.1 质粒制备50-51
• 5.2.2 包装病毒51-52
• 5.2.3 慢病毒感染HGC-27细胞52
• 5.2.4 细胞总RNA提取52-53
• 5.2.5 逆转录反应53
• 5.2.6 实时荧光定量PCR53
• 5.2.7 Western blot53
• 5.2.8 平板克隆形成实验53
• 5.2.9 细胞免疫荧光53
• 5.2.10 成脂诱导实验53-54
• 5.3 结果54-61
• 5.3.1 HGC-27细胞PORCN的干扰效果确证54-55
• 5.3.2 低剂量的DIM通过诱导HGC-27细胞Wnt自分泌来活化 β-catenin促进胃癌进展55-57
• 5.3.3 筛检低剂量DIM诱导表达上调的Wnts分子57
• 5.3.4 低剂量的DIM增强HGC-27细胞Wnt4的表达57-58
• 5.3.5 HGC-27细胞WNT4的干扰效果确证58-59
• 5.3.6 WNT4干扰对HGC-27细胞蛋白表达的影响59-60
• 5.3.7 低剂量的DIM通过增强HGC-27细胞Wnt4自分泌活化 β-catenin促进胃癌进展60-61
• 5.4 讨论61-63
• 第六章 低浓度的DIM促进胃癌细胞的体内成瘤63-71
• 6.1 材料63-65
• 6.1.1 细胞株63
• 6.1.2 主要试剂63-64
• 6.1.3 主要仪器及相关耗材64
• 6.1.4 实验动物64-65
• 6.2 方法65-66
• 6.2.1 细胞培养65
• 6.2.2 裸鼠皮下荷瘤模型65
• 6.2.3 组织RNA提取65
• 6.2.4 逆转录反应65
• 6.2.5 实时荧光定量PCR65
• 6.2.6 肿瘤组织病理分析65
• 6.2.7 免疫组织化学65-66
• 6.2.8 组织免疫荧光66
• 6.2.9 统计分析66
• 6.3 结果66-70
• 6.3.1 低剂量的DIM促进胃癌细胞的体内生长66-67
• 6.3.2 低剂量的DIM促进裸鼠瘤组织Snail和N-cadherin的表达67-68
• 6.3.3 低剂量的DIM在体内促进瘤组织Wnt4、β-catenin和CD44的表达68-70
• 6.4 讨论70-71
• 第七章 结论与展望71-73
• 7.1 结论71-72
• 7.2 展望72-73
• 参考文献73-82
• 致谢82-84
• 攻读硕士学位期间发表的科研成果及参加的学术会议84-85

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