卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究及中华补血草LsNHXs基因的功能研究

【摘要】： 第一章卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究 甲基溴是在全球被广泛采用的一种熏蒸杀虫剂,但是,甲基溴对臭氧层和环境有破坏作用。国际组织呼吁尽快淘汰甲基溴,因此,甲基溴替代技术的开发迫在眉睫。 卤代甲烷的生物合成由以下酶促反应完成:SAM(S-腺苷甲硫氨酸)+ X-(Cl-,Br-,I-)→CH3X + S-adenosylhomocysteine(S-腺苷高半胱氨酸),反应由一种甲基转移酶(methyl chloride transferase MCT)催化完成。本实验克隆了来源于甜土植物—拟南芥及来源于盐生植物—盐芥和盐地碱蓬的MCT基因AtMCT(AtHOL)、ThMCT和SsMCT。通过基因工程手段将这三个基因转入烟草,实现基因的过量表达。 土壤甲基溴熏蒸的目标在于杀死具有较高耐药性的病源物的孢子或其他休眠形式,熏蒸所需浓度高,这也是造成环境污染的原因。通过转基因手段,赋予转基因烟草微量、持续产生甲基溴的能力,病源物侵染时可直接对其作用,从而替代甲基溴土壤熏蒸。此技术在国内外尚属首创。 主要实验结果如下: 1)利用RT-PCR和RACE方法克隆获得ThMCT和SsMCT基因的全长序列。ThMCT基因全长923 bp,开放阅读框为681 bp,共编码226个氨基酸,蛋白分子量约为25.1 KD。SsMCT基因全长1094 bp,开放阅读框为699 bp,共编码232个氨基酸,蛋白分子量约为25.8 KD。 2)将AtMCT、ThMCT和SsMCT的全长ORF构建到植物双元表达载体pINT4中,用农杆菌介导的叶圆盘法转化烟草,分别获得了18个AtMCT、20个ThMCT和38个SsMCT基因独立的转化株系。 3)对转基因植株进行分子鉴定。PCR分析、Southern和Northern杂交结果表明外源基因已整合进烟草的基因组中并正常转录。用总蛋白作Western杂交,三种转基因植株均有杂交信号。但是如果主要用可溶性蛋白作Western杂交,则只有AtMCT转基因植株有杂交信号,而ThMCT和SsMCT转基因植株均没有杂交信号。 4)用不同浓度的处理液处理野生型和转基因烟草,用气/质联用仪测定其CH3Cl、CH3Br和CH3I的释放量。AtMCT转基因植株a12三种气体的释放量明显高于野生型对照,是对照的100倍左右,而ThMCT和SsMCT转基因植株的释放量和对照差异不明显。 5)对AtMCT转基因植株a12和野生型植株接种线虫,在施加Br-,增加底物的情况下,AtMCT转基因植株提高了对线虫的抗性。 第二章中华补血草LsNHXs基因的功能研究 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐逆密切相关,它利用液泡膜H+-ATPase及H+-PPase泵H+产生的驱动力把Na+区隔化入液泡中以消除Na+的毒害,除此之外,液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白还与PH调节、囊泡运输、液泡的发育以及蛋白质分选有关。液泡不仅是一个物质储存细胞器,在特定的生理条件下,某些植物细胞的液泡可参与矿质离子、简单糖类、有机酸和氨基酸等物质的运输。 早期的电镜观察发现,补血草盐腺分泌细胞内有大量的线粒体和丰富的内质网,缺少清晰的中央大液泡,但细胞内有许多液泡样的小囊泡,小囊泡大部分都靠近细胞质膜且经常出现与质膜的融合,推测囊泡运输参与了补血草的泌盐过程。由此推测补血草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白LsNHXs将对补血草的泌盐产生一定的影响。因此,本实验克隆了LsNHXs基因,并利用RNAi技术对其功能进行了研究。 主要实验结果如下: 1)采用RT-PCR和3’-RACE方法从补血草中克隆获得LsNHXs基因家族三个成员LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的保守区序列以及LsNHX2和LsNHX3的3’端特异序列。 2)构建植物基因RNAi沉默表达载体并转化补血草,获得三个单基因和一个双基因的RNAi沉默表达植株,快繁转基因植株供分子鉴定和耐逆分析。 3)LsNHX1转基因植株叶片表面分泌物中的Na+、K+离子含量比野生型对照显著增加;叶组织内Na+离子含量和K+离子含量均略高,但差异不显著;K+/Na+比没有显著差异。 4)LsNHX2转基因植株叶片表面分泌物中的Na+离子含量比野生型对照有所下降,但差异不显著;K+离子含量比对照显著降低。LsNHX2转基因植株叶组织内Na+离子含量略高,但差异不显著;K+离子含量和K+/Na+比均降低。 5)LsNHX3转基因植株叶片表面分泌物中的Na+离子含量比对照增加,但差异不显著,K+离子含量比对照增加,在400 mM NaCl条件下达到显著差异;叶组织内Na+离子含量和K+离子含量均略高;K+/Na+比没有显著差异。 6)LsNHX1+LsNHX2双基因沉默植株叶片表面分泌物中的Na+离子含量比野生型对照增加,K+离子含量与野生型对照相比没有显著差异。转基因植株叶中Na+离子含量略高,但差异不显著;转基因植株叶中K+离子含量及K+/Na+比均降低。 以上结果表明,LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的作用机制不同。LsNHX2可能定位于小囊泡上,沉默表达后,区隔化的Na+离子含量降低,导致通过囊泡运输分泌的Na+离子含量降低。LsNHX1和LsNHX3可能定位于中央大液泡上,主要负责Na+的区隔化;沉默表达后,液泡中区隔化的Na+离子含量降低,胞质中的Na+离子含量增加,刺激盐腺泌盐,导致叶片分泌的Na+离子含量增加。 本研究的主要创新点: 1.首次克隆了盐生植物—盐芥、盐地碱蓬的卤代甲烷甲基转移酶基因ThMCT和SsMCT,并对其序列特征进行了详细的分析。 2.通过过量表达卤代甲烷甲基转移酶基因,提高转基因烟草释放甲基溴的能力,使转基因烟草微量、持续产生甲基溴,从而替代甲基溴土壤熏蒸。此技术在国内外尚属首创。 3.首次克隆了补血草的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白LsNHXs基因家族三个成员LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的部分序列,并将这三个基因分别作了RNAi沉默表达。研究发现LsNHX1、LsNHX2、LsNHX3的作用机制不同。LsNHX2可能定位于小囊泡上,通过囊泡运输对补血草的泌盐起一定的作用,而LsNHX1和LsNHX3可能定位于中央大液泡上,主要负责Na+的区隔化。 【关键词】：卤代甲烷甲基转移酶基因MCT 甲基溴 根结线虫 补血草 囊泡运输 Na~+/H~+逆向转运蛋白 LsNHXs
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要8-11
• Abstract11-17
• 第一部分 文献综述17-46
• 一、卤代甲烷酶促合成机制17-20
• 1 卤代甲烷的生物产生机制17-18
• 2 卤代甲烷甲基转移酶基因的克隆18-19
• 3 卤代甲烷酶促反应机制的生物学意义19-20
• 4 卤代甲烷的植物发生论20
• 二、Na~+/H~+逆向转运蛋白20-38
• 1 Na~+/H~+逆向转运蛋白的分子特性及转运机制21-27
• 1.1 Na~+/H~+逆向转运蛋白的进化分类和亚细胞定位21-23
• 1.2 Na~+/H~+逆向转运蛋白的拓扑结构和功能残基23-26
• 1.2.1 NHE 的结构与功能调节24
• 1.2.2 酵母和真菌质膜Na~+/H~+逆向转运蛋白C 端的功能24-25
• 1.2.3 植物液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白的结构25-26
• 1.3 大肠杆菌EcNhaA 的Na~+/H~+逆向转运机制26-27
• 2 植物液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白27-31
• 2.1 植物液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因家族27-28
• 2.2 植物液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白阳离子选择性28
• 2.3 植物液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白与植物耐盐性28-30
• 2.4 植物液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白的其它功能30-31
• 3 NHE/NHX Na~+/H~+逆向转运蛋白与囊泡运输31-33
• 4 植物质膜Na~+/H~+逆向转运蛋白33-38
• 4.1 植物质膜Na~+/H~+逆向转运蛋白与植物耐逆的关系33-35
• 4.2 SOS 信号通路35-38
• 4.2.1 SOS 信号通路元件35-36
• 4.2.2 SOS 信号通路36-37
• 4.2.3 SOS 信号通路的保守性37-38
• 4.3 AtNHX838
• 三、囊泡介导的植物细胞可溶性物质的转运38-43
• 1 囊泡参与盐的分泌39-40
• 2 囊泡参与蜜的分泌40-41
• 3 囊泡参与有机酸和蔗糖的分泌41-42
• 4 囊泡参与保卫细胞和运动细胞的溶质运输42
• 5 囊泡参与糖和黏附多糖的分泌42-43
• 四、本实验的意义43-46
• 1 甲基溴替代技术的开发43-44
• 2 中华补血草泌盐机制探讨44-46
• 第二部分 实验论文46-106
• 第一章 卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究46-73
• 一、实验材料46-48
• 1 植物材料及线虫46
• 2 菌种及质粒46
• 3 酶及化学试剂46
• 4 主要仪器设备46-47
• 5 质粒提取液47
• 6 培养基47-48
• 7 引物序列48
• 二、实验方法48-61
• 1 基本分子生物学实验技术49-55
• 1.1 大肠杆菌感受态的制备及转化49
• 1.2 质粒的提取49-50
• 1.3 PCR、酶切以及连接50
• 1.4 Gene Clean 方法从琼脂糖凝胶上回收外源基因片段50
• 1.5 植物基因组DNA 的提取及Southern 杂交膜的制备50-51
• 1.5.1 植物基因组DNA 的提取—CTAB 法50-51
• 1.5.2 Southern 杂交膜的制备51
• 1.6 Trizol 试剂提取植物总RNA51-52
• 1.7 异硫氰酸胍法提取植物总RNA 及Northern 杂交膜的制备52-53
• 1.7.1 植物组织总RNA 的提取—异硫氰酸胍法52-53
• 1.7.2 Northern 杂交膜的制备53
• 1.7.2.1 RNA 甲醛变性胶电泳53
• 1.7.2.2 RNA 杂交膜的制备53
• 1.8 Southern 杂交和Northern 杂交分析53-54
• 1.8.1 cDNA 探针的制备53-54
• 1.8.2 杂交过程54
• 1.8.3 洗膜及显影54
• 1.9 Western 杂交54-55
• 1.9.1 植物蛋白的提取方法一54
• 1.9.2 植物蛋白的提取方法二—丙酮沉淀法54-55
• 1.9.3 SDS-PAGE55
• 1.9.4 转膜55
• 1.9.5 Western 检测55
• 2 ThMCT、SsMCT 基因的克隆55-58
• 2.1 ThMCT、SsMCT 基因保守区的克隆55-56
• 2.2 ThMCT、SsMCT 基因5’端序列的克隆56-58
• 2.3 ThMCT、SsMCT 基因3’端序列的克隆58
• 3 AtMCT、ThMCT 和SsMCT 基因过量表达载体的构建58-59
• 4 植物表达载体的农杆菌转化与鉴定59
• 5 农杆菌介导的烟草转化59-60
• 6 转基因烟草的PCR 鉴定60
• 7 转基因烟草卤代甲烷释放量的测定60-61
• 8 转基因烟草的线虫抗性实验61
• 三、实验结果61-71
• 1 MCT 基因的克隆及序列分析61-66
• 1.1 ThMCT 基因的克隆61-62
• 1.2 SsMCT 基因的克隆62-63
• 1.3 ThMCT 和SsMCT 的氨基酸序列分析63-64
• 1.4 ThMCT 和SsMCT 的系统谱系分析64-65
• 1.5 AtMCT、ThMCT 和SsMCT 的拓扑结构分析65-66
• 2 AtMCT、ThMCT 和SsMCT 基因过量表达载体的构建66
• 3 植物表达载体的农杆菌转化与鉴定66
• 4 农杆菌介导的烟草转化66
• 5 转基因烟草的分子鉴定66-69
• 5.1 转基因烟草的PCR 分析66
• 5.2 转基因烟草的Southern 杂交分析66-67
• 5.3 转基因烟草的Northern 杂交分析67-68
• 5.4 转基因烟草的Western 杂交分析68-69
• 6 转基因烟草卤代甲烷释放量的测定69-70
• 7 转基因烟草的线虫抗性实验70-71
• 四、讨论71-73
• 1 ThMCT 和SsMCT 的序列特征71
• 2 过量表达AtMCT 提高了转基因烟草对线虫的抗性71-73
• 第二章 中华补血草LsNHXs 基因的功能研究73-106
• 一、实验材料73-75
• 1 植物材料73
• 2 菌种及质粒73
• 3 酶及化学试剂73
• 4 主要仪器设备73
• 5 质粒提取液73
• 6 培养基73-74
• 7 引物序列74-75
• 二、实验方法75-84
• 1 基本分子生物学实验技术75-77
• 1.1 大肠杆菌感受态的制备及转化75
• 1.2 质粒的提取75
• 1.3 PCR、酶切以及连接75
• 1.4 Gene Clean 方法从琼脂糖凝胶上回收外源基因片段75
• 1.5 植物基因组DNA 的提取及Southern 杂交分析75
• 1.6 Trizol 法和异硫氰酸胍法提取植物总RNA75
• 1.7 CTAB 改良法提取中华补血草总RNA75-76
• 1.8 DNaseI (RNase Free) 去除补血草RNA 中的基因组DNA76-77
• 2 中华补血草LsNHXs 基因的克隆77-78
• 2.1 中华补血草LsNHXs 基因保守区的克隆77
• 2.2 LsNHX2 和LsNHX3 基因3’端序列的克隆77-78
• 3 LsNHXs 基因RNAi 沉默表达载体的构建78-79
• 3.1 LsNHX1、LsNHX2、LsNHX3 单基因RNAi 沉默表达载体的构建78-79
• 3.2 LsNHX1+LsNHX2 双基因RNAi 沉默表达载体的构建79
• 4 植物表达载体的农杆菌转化与鉴定79-80
• 5 中华补血草的遗传转化80
• 5.1 农杆菌菌液的制备80
• 5.2 补血草叶片的转化80
• 5.3 抗性芽的生根80
• 5.4 抗性苗的快速繁殖及移栽80
• 6 转基因补血草的分子鉴定80-82
• 6.1 转基因补血草的PCR 鉴定80-81
• 6.2 转基因补血草LsNHXs 基因表达的Real-time PCR 分析81-82
• 6.2.1 补血草RNA 的提取及定量81
• 6.2.2 RNA 的反转录及cDNA 模板的稀释81
• 6.2.3 实时定量PCR 引物的设计81-82
• 6.2.4 实时定量PCR（Real-time PCR）82
• 6.2.5 Real Time PCR 数据分析的方法82
• 7 转基因补血草的耐逆性分析82-84
• 7.1 野生型与转基因补血草的快速繁殖82-83
• 7.2 野生型与转基因补血草的盐胁迫处理83
• 7.3 叶片表面分泌物中Na~+、K~+离子含量的测定83
• 7.4 叶面积的测定83
• 7.5 叶片组织内Na~+、K~+离子含量的测定83
• 7.6 植物材料含水量的测定83-84
• 三、实验结果84-103
• 1 中华补血草LsNHXs 基因的克隆84-89
• 1.1 中华补血草RNA 的提取84
• 1.2 中华补血草LsNHXs 基因保守区的克隆84-86
• 1.3 LsNHX2 和LsNHX3 基因3’端序列的克隆86-89
• 2 LsNHXs 基因RNAi 沉默表达载体的构建89-92
• 2.1 LsNHXs 单基因RNAi 沉默表达载体的构建及酶切验证89-90
• 2.1.1 LsNHXs 单基因RNAi 沉默表达载体的构建89-90
• 2.1.2 LsNHXs 单基因RNAi 沉默表达载体的酶切验证90
• 2.2 LsNHX1+LsNHX2 双基因RNAi 沉默表达载体的构建及酶切验证90-92
• 3 植物基因RNAi 沉默表达载体的农杆菌转化及PCR 验证92
• 4 中华补血草的遗传转化92
• 5 转基因补血草的分子鉴定92-96
• 5.1 转基因补血草的PCR 鉴定92-93
• 5.2 转基因补血草的Southern 杂交分析93-94
• 5.3 转基因补血草LsNHXs 基因表达的Real-time PCR 分析94-96
• 6 转基因补血草的耐逆性分析96-103
• 6.1 LsNHX2 转基因补血草的耐逆性分析96-98
• 6.1.1 LsNHX2 转基因补血草在不同盐胁迫条件下的生长情况96
• 6.1.2 盐处理对LsNHX2 转基因植株与野生型植株含水量的影响96
• 6.1.3 盐处理对LsNHX2 转基因植株与野生型植株叶片表面分泌物中Na~+、K~+离子含量的影响96-97
• 6.1.4 盐处理对LsNHX2 转基因植株与野生型植株叶片组织内Na~+、K~+离子含量的影响97-98
• 6.2 LsNHX1、LsNHX3 和LsNHX1~+LsNHX2 转基因补血草的耐逆性分析98-103
• 6.2.1 LsNHX1、LsNHX3 和LsNHX1+LsNHX2 转基因补血草在不同盐胁迫条件下的生长情况98
• 6.2.2 盐处理对LsNHX1、LsNHX3 和LsNHX1+LsNHX2 转基因植株与野生型植株含水量的影响98-99
• 6.2.3 盐处理对LsNHX1 转基因植株与野生型植株叶片表面分泌物中Na~+、K~+离子含量的影响99-100
• 6.2.4 盐处理对LsNHX1 转基因植株与野生型植株叶片组织内Na~+、K~+离子含量的影响100
• 6.2.5 盐处理对LsNHX3 转基因植株与野生型植株叶片表面分泌物中Na~+、K~+离子含量的影响100-101
• 6.2.6 盐处理对LsNHX3 转基因植株与野生型植株叶片组织内Na~+、K~+离子含量的影响101
• 6.2.7 盐处理对LsNHX1+LsNHX2 转基因植株与野生型植株叶片表面分泌物中Na~+、K~+离子含量的影响101-102
• 6.2.8 盐处理对LsNHX1+LsNHX2 转基因植株与野生型植株叶片组织内Na~+、K~+离子含量的影响..102-103
• 四、讨论103-106
• 1 中华补血草RNA 的提取103-104
• 2 RNAi 技术在植物功能基因组学研究中的应用104
• 3 中华补血草液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白LsNHXs 对其耐盐性的影响104-106
• 图版106-110
• 参考文献110-121
• 攻读博士学位期间发表的论文121-122
• 致谢122

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替代甲基溴的土壤消毒技术    张成省,孔凡玉,王凤龙,李联玉

杀灭棉花红铃虫的良药甲基溴自制成功    

福建省经济作物寄生线虫的研究——Ⅳ.福建根结线虫的扫描电镜观察    潘沧桑,林竞,王生元

海洋降解缩短了甲基溴在大气中的寿命    英

不可忽视的作物根结线虫病    石鸿文,潘晟

海南岛林木根结线虫    何宏珍,段定仁

根结线虫的种类及其寄主植物续述    潘沧桑,林竞,王生元,吴顺章

根结线虫生防菌剂介绍    方新,王志学,周建树

大花补血草优株无性系的建立    倪跃元,朱锦文,赵晓艺

甲基溴替代技术对番茄根结线虫和土壤自由生活线虫种群动态的影响    陈云峰;曹志平;

26%磷化钙块剂作为溴甲烷替代剂对土壤根结线虫的影响    仉欢;王开运;

辽宁省蔬菜根结线虫病的发生与危害    陈立杰;段玉玺;朱晓峰;白春明;魏峰;刘维志;

甲基溴土壤消毒替代技术的综合评价    曹志平;郑长英;陈国康;陈云峰;杨杭;

蔬菜根结线虫防治方法研究进展    闵红;楚桂芬;周新强;周亚东;

19个烟草品种对三种常见根结线虫抗性测定的研究    白万明;俞盛甫;胡先奇;吴正举;

4种根结线虫的rDNA-ITS研究    彭德良;S.A.Subbotin;Maurice Moens;

根结线虫生物防治研究进展    祝明亮;

山东石榴根结线虫的发生与防治    孙瑞红;于欣;苑兆和;尹燕雷;侯乐峰;郝兆祥;杨福;

蔬菜根结线虫病的生物防治初报    杨雪梅;陈爱英;毕章宝;王马的;戴慧萍;师素英;闫新新;

采纳政协建议 安丘农产品病害有了环保“药方”    殷永 陈鑫

甲基溴淘汰势不可挡    李红兵

国家环保部甲基溴淘汰现场验收组到德昌检查工作    罗睿 周国璐

不用甲基溴 虫害可解决    方芳

我国就淘汰甲基溴行动方案进行研讨    记者 宗建树

山东安丘：农民种上环保田    记者 单保江　通讯员 田杰

蔬菜关键生产技术问答    王芳德　刘文宝

省农科院选出5种高效低毒杀虫剂    记者 范南虹　通讯员 谢琼

补血草栽培法    雨帆　编译

我国甲基溴替代品畅销海外    记者 张兴刚 张建民

卤代甲烷甲基转移酶基因转化烟草的研究及中华补血草LsNHXs基因的功能研究    李维焕

Bacillus cereus X5的杀线活性及其生物有机肥对南方根结线虫的防治作用研究    肖同建

根结线虫拮抗放线菌的筛选及菌株HA10002和DA09202活性物质的研究    曾庆飞

水稻根部线虫鉴定及潜根线虫根结线虫对水稻的致病性    谢志成

二硫氰基甲烷防治番茄根结线虫病（Meloidogyne spp.）的研究及其对土壤生态的影响    祁之秋

抗性砧木嫁接番茄控制土传病害的研究    郑长英

辣椒与根结线虫不亲和互作相关基因的分离及功能分析    茆振川

酿酒酵母中TRAPP复合体的三个亚基在囊泡运输和细胞自噬中的功能研究    刘玉涛

酿酒酵母中TRAPP复合体专一性亚基在囊泡运输和细胞自噬中的功能研究    邹珅珅

甲基溴替代技术条件下温室土壤生物群落特征及地下食物网研究    陈国康

甲基溴替代技术对番茄根结线虫和土壤自由生活线虫种群动态的影响    陈云峰

根结线虫种群密度对我国北方蔬菜生长的影响    耿亚玲

防治根结线虫的溴甲烷替代技术筛选    李为

根结线虫生防菌的筛选及其生物有机肥研制    陈芳

利用DDRT-PCR技术鉴定和克隆盐生植物补血草（Limonium sinense O）耐盐相关基因    战祥强

敏感型葡萄品种对根结线虫侵染的生理生化响应    王凤攀

抗根结线虫红树林放线菌的分离、筛选及三株活性菌株的鉴定    魏华

辣椒抗根结线虫基因Me3的精细定位研究    许小艳

甲基溴土壤消毒替代技术对温室土壤原生动物群落的影响    杨杭

黄瓜抗根结线虫基因工程的初步研究    孟莎莎