高温油藏微生物群落结构及石油烃厌氧降解产甲烷体系构建研究

【摘要】：烷烃的厌氧生物降解对于石油工业的研究具有重要意义。该过程的研究对于理解深层地下油藏中石油的生物降解,以及油污染环境的生物修复具有重要价值。在过去的二十年间,烷烃厌氧降解微生物以及生化途径的研究已有一定进展。在厌氧条件下,烷烃可用作唯一的碳源和能源被不同类型的微生物利用。 本文以高温油藏产出液为接种物采用富集培养的方法构建石油烃厌氧降解产甲烷体系。经过528天的驯化,体系中产出400μmol甲烷,占预测总产量的19.8%；16S rRNA基因克隆文库分析表明,体系中细菌主要属于厚壁菌门(Fimicutes)中的Coprothermobacter类型,同时还存在Thermotoga, Thermodesulfovibrio (Nitrospira), Actinobacteria, Candidate Division OP8以及具有共生产乙酸能力的Moorella thermoacetica类型的细菌；体系中的古菌主要是CO2还原型的产甲烷菌以及具有硫酸盐还原能力的Archaeoglobus sp类型的古细菌：对体系中的中间代谢产物分析表明,气体中偶尔检测到低浓度的氢气,挥发性脂肪酸中检测到甲酸和乙酸；此外,编码烷基琥珀酸盐合成酶的功能基因(assA)首次在高温条件下烷烃厌氧降解产甲烷样品中检测到。未添加烷烃的平行样品在经过528天的培养之后作为接种物,以原油为唯一碳源和能源,构建石油烃厌氧降解产甲烷体系,经过45天的延滞期后,转接添加原油的体系中开始产生甲烷,550天后甲烷的产量达到135.30μmol,是消耗石油烃(C9-C33)理论甲烷产量的14.6%,相反,在未添加原油的背景对照体系中未见有甲烷产生,表明在经过前一阶段528天的厌氧培养后,体系中不存在可被微生物厌氧转化为甲烷的碳源；此外在体系中还检测到低浓度的氢气、甲酸、乙酸和丁酸等类型的中间代谢产物,16S rRNA基因克隆文库分析表明,体系中的细菌主要是Chloroflexi, Thermotoga, Actinobacteria, Nitrospira和Firmicutes;古菌主要是嗜热的氢营养型的产甲烷菌Methanothermobacter spp和硫酸盐还原古细菌Archaeoglobus,以上结果表明石油烃可能被降解成乙酸,乙酸进一步共生氧化成氢气和二氧化碳后被转化成甲烷。 本研究对象为高温油藏产出液及高温石油烃降解产甲烷体系,为认识高温油藏中的石油烃厌氧转化提供了理论基础,此外功能基因的研究结果丰富了厌氧烃降解功能基因的数据库,进一步拓展了分子标记物在油藏及油污染环境的应用。 【关键词】：高温油藏 厌氧降解 分子标记 微生物菌群 烃厌氧降解产甲烷
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X741
【目录】：

• Abstract5-7
• 摘要7-11
• Chapter 1 General Introduction11-33
• 1.1 Fundamental reasons for studying oil hydrocarbon-associated microbial communities11-12
• 1.2 Anaerobic Degradation of Petroleum Hydrocarbons12-31
• 1.2.1 Aromatic Hydrocarbons13-14
• 1.2.2 Saturated hydrocarbons14-15
• 1.2.3 Microbial communities involved in anaerobic degradation of alkanes15-27
• 1.2.4 Biochemical activation strategies for anaerobic degradation of alkanes27-31
• 1.3 Summary31-32
• 1.4 Summary of experimental approach32-33
• Chapter 2 Limited diversity of anaerobes in production water from a hightemperature petroleum reservoir33-47
• 2.1 Site and sampling33
• 2.2 Materials and Methods33-40
• 2.2.1 Equipments33-34
• 2.2.2 Reagents and culture media used for molecular cloning34-35
• 2.2.3 Chemical analyses35-36
• 2.2.4 Nucleic acid extraction36
• 2.2.5 PCR amplifications 16S rRNA genes36-37
• 2.2.6 PCR amplification of bssA and bamA gene fragments37-38
• 2.2.7 Construction of clones libraries38-39
• 2.2.8 Sequencing and phylogenetic analysis39-40
• 2.3 Results and Discussion40-46
• 2.3.1 Physicochemical characteristics of the production water from Well 3-18-3540
• 2.3.2 Phylogenetic analyses of microbial assemblage in the production water40-46
• 2.4 Summary46-47
• Chapter 3 Methanogenic alkane-dependent microbial community derived fromproduction water of high temperature petroleum reservoir47-62
• 3.1 Site and sampling47
• 3.2 Materials and Methods47-51
• 3.2.1 Preparation of enrichment cultures47-48
• 3.2.2 Chemical analyses48-49
• 3.2.3 Nucleic acid extraction49
• 3.2.4 PCR amplifications 16S rRNA genes49-50
• 3.2.5 PCR amplification of alkylsuccinate synthase α-subunit (assA) and methyl-coenzymeM reductase subunit A (mcrA) genes fragments50
• 3.2.6 Construction of clones libraries50-51
• 3.2.7 Sequencing and phylogenetic analysis51
• 3.3 Results and Discussion51-60
• 3.3.1 Physicochemical characteristics of the production water from SL3451
• 3.3.2 Alkane-dependent methanogenesis in thermophilic enrichment cultures51-52
• 3.3.3 Microbial community composition of the thermophilic n-alkane-dependentmethanogenic cultures52-60
• 3.4 Summary60-62
• Chapter 4 Anaerobic degradation of crude oil by a thermophilic methanogenicconsortium62-74
• 4.1 Materials and methods62-64
• 4.1.1 Transfer of primary enrichment and preparation of methanogenic oil-degradingcultures62-63
• 4.1.2 Crude oil and metabolites analyses63-64
• 4.1.3 Nucleic acid extraction64
• 4.1.4 PCR amplifications of bacterial and archaeal 16S rRNA genes64
• 4.1.5 Construction of clones' libraries64
• 4.1.6 Sequencing and phylogenetic analysis64
• 4.2 Results and Discussion64-71
• 4.2.1 Crude oil degradation and methane formation in thermophilic enrichment cultures64-67
• 4.2.2 Analysis of volatile fatty acids (VFA) in the methanogenic enrichment cultures67-68
• 4.2.3 Microbial community composition of the oil-degrading methanogenic cultures68-71
• 4.3 Summary71-74
• Chapter 5 Bacterial diversity in methanogenic alkane-degrading enrichmentestablished from oily sludge characterized by catabolic functional genes74-81
• 5.1 Materials and Methods75-76
• 5.1.1 Sampling site of oily sludge75
• 5.1.2 Preparation of enrichment cultures75
• 5.1.3 Nucleic acid extraction75
• 5.1.4 PCR amplification of functional gene fragments75
• 5.1.5 Sequencing and phylogenetic analysis75
• 5.1.6 Construction of catabolic functional genes clones libraries75-76
• 5.2 Results and Discussion76-79
• 5.3 Summary79-81
• Chapter 6 General Conclusions and Future Work81-84
• References84-98
• Acknowledgements98-99
• Publications List99-100
• Appendix100-102

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