晋南牛和山羊瘤胃产甲烷菌多样性研究

【摘要】：瘤胃产甲烷菌代谢产生的甲烷气体,既是饲料能量的损失,又能引起温室效应,因此成为当前的一个研究热点。了解瘤胃产甲烷菌群的组成及其多样性是对其菌群结构进行调控,并最终控制甲烷产生的基础。迄今为止,国内对瘤胃产甲烷菌群多样性的研究尚无报道,国外的相关研究多集中于绵羊和奶牛瘤胃中产甲烷菌的多样性,而对于产甲烷菌消化道不同部位(如瘤胃和盲肠)的分布方面鲜见报道。为此,本研究以晋南牛和山羊为试验动物,以克隆产甲烷古菌16S rRNA基因并测序的方法,研究了晋南牛和山羊瘤胃产甲烷古菌的多样性,并通过比较克隆库间的差异,揭示了产甲烷菌在瘤胃和盲肠中分布特点,为探讨我国反刍动物瘤胃甲烷调控奠定基础。试验分以下四部分进行。 1研究瘤胃产甲烷古菌分子多样性的引物筛选 采用两对古菌特异性引物(Arch f64/1386和1Af/1100Ar)和一对产甲烷菌特异性引物(Met86F/Met1340R)克隆晋南牛瘤胃产甲烷古菌的16S rRNA基因,每对引物对应的克隆库各随机挑选100个插入片段长度正确的克隆,比较不同引物建立的克隆库,以选择出适合反映瘤胃产甲烷古菌多样性的引物。结果显示,利用引物Archf364/1386建立的克隆库中,克隆的最相似菌分别为4株甲烷短杆菌1Y(61%)、SM9(23%)、NT7(14%)和AK-87(2%)。利用引物1Af/1100Ar建立的克隆库中,克隆分别与Methanobacterium aarhusense(72%)和Methanosphaera stadtmanae DSM 3091 (28%)相似。利用引物Met86F/Met1340R建立的克隆库中,除以上4株甲烷短杆菌(所占比例分别为47%、26%、11%和3%)和类似M. aarhusense (1%)和M. stadtmanae (3%)的序列外,还包括Methanomicrobium mobile (2%)以及7%与Aciduliprofundum boonei相似性在81%-82%之间的序列。结果说明,相对其它两对引物,引物Met86F/Met1340R克隆的瘤胃产甲烷古菌种类最多,归属于甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、甲烷微菌属(Methanomicrobium),以及未知菌等广域古菌的五个分支,能较全面地反映晋南牛瘤胃产甲烷菌菌群结构,适于研究瘤胃产甲烷菌的多样性。结果同时发现,晋南牛瘤胃中,有25个OTU属于广域古菌的未知序列,提示瘤胃中存在大量的未知产甲烷菌。 2产甲烷古菌在瘤胃中的生态分布研究 采用产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R,分别建立了晋南牛瘤胃液相(liquid-associated methanogen, LAM)、附着于瘤胃固相(solid-associated methanogen,SAM)和附着于瘤胃壁(epithelium-associated methanogen, EAM)上的产甲烷古菌16SrRNA基因克隆库,以比较瘤胃产甲烷菌在此三相间的分布差异。LAM、SAM和EAM三个克隆库检测的克隆数分别为268个、135个和267个。比较三个克隆库,其中皆以甲烷短杆菌属的克隆为主,分别占克隆总数的86.94%、77.78%和76.12%,且均含有1Y和SM9两株产甲烷短杆菌及类似M. alcaliphilum、M. stadtmanae和A. boonei的序列;此外,可活动甲烷短杆菌和类似M. aarhusense、M. stadtmanii和Methanobrevibacter sp. AbM4的序列仅存在于LAM克隆库中；反刍兽甲烷短杆菌仅存在于SAM克隆库中；类似Methanobrevibacter sp. SM9的序列仅存在于EAM克隆库中；而类似Methanobrevibacter sp. AK-87的序列存在于LAM和SAM克隆库中；在LAM. SAM和EAM克隆库中,分别有12.30%、23.69%和24.71%的克隆是未确定的广域古菌序列,其中有五个序列(E17、E18、E19、L25和S14)是新发现的广域古菌序列。结果表明,产甲烷古菌在瘤胃中的分布不均匀,附着于瘤胃液相、固相和上皮上的产甲烷古菌菌群存在一定的差异。 3瘤胃与盲肠中产甲烷古菌的比较研究 采用产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R,建立了晋南牛瘤胃和盲肠中产甲烷古菌的克隆库,以比较两个消化部位产甲烷古菌菌群的差异。每个克隆库中分别随机检测200个克隆,根据限制性内切酶酶切和测序的结果,瘤胃克隆库中的克隆分别与M. alcaliphilum (1%), M. aarhusense (2%), M. stadtmanae (3%), M. stadtmanii (1%),可活动甲烷微菌(2%),A. boonei (11.5%),和甲烷短杆菌属的反刍兽(0.5%),SM9(26%),1Y(44.5%),AK-87(6%),NT7(2%),AbM4(0.5%)等菌最相似。盲肠克隆库中,克隆的最相似菌分别为M. alcaliphilum (5%), M. aarhusense (1%), M stadtmanae (4%),和甲烷短杆菌属的SM9(54.5%),1Y(27%),AK-87(6.5%),NT7(2%)。比较两个克隆库,在盲肠内未克隆到存在于瘤胃克隆库中的可活动甲烷微菌和类似于Methanobrevibacter sp.1Y、M. stadtmanii、Methanobrevibacter sp. AbM4和A. boonei的克隆,而瘤胃中未克隆获得类似Methanobrevibacter sp. SM9的克隆。结果表明,瘤胃与盲肠的产甲烷菌菌群存在一定的差异,盲肠中的产甲烷菌种类较单一。 4山羊瘤胃产甲烷古菌的分子多样性研究 采用产甲烷菌特异性引物Met86F/Met1340R和古菌通用引物w017/w002研究了山羊瘤胃产甲烷古菌16S rRNA基因的多样性,以反映山羊瘤胃产甲烷菌菌群。每个克隆库随机挑选100个克隆。引物Met86F/Met1340R建立的克隆库中,克隆的最相似菌分别为M. stadtmanae (1%)、M. aarhusense(2%)、A. boonei (3%)及6株甲烷短杆菌AK-87(62%)、ZA-10(19%)、OCP(7%)、SM9(2%)、30Y(2%)和1Y(2%)。引物w017/w002建立的克隆库中,未知广域古菌克隆占克隆总数的97%,克隆分别与Methanosphaera stadtmanii(47%)、Methanobrevibacter sp. SM9(1%)、Methanobacterium sp. DSM 11106(21%)、M. stadtmanae DSM 3091(4%)、Methanobacterium alcaliphilum (3%)、Methanobacterium sp. OM15 (1%)、Picrophilus oshimae (4%)和A. boonei(19%)最相似,但此对引物能克隆出细菌。 【关键词】：晋南牛 山羊 胃肠道产甲烷菌 多样性
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：S852.6
【目录】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 引言12-13
• 第一篇 文献综述13-35
• 第一节 产甲烷菌多样性概述概述13-17
• 第二节 反刍动物产瘤胃甲烷菌17-29
• 第三节 分子生物学技术在瘤胃产甲烷菌多样性和菌群结构研究中的应用29-33
• 第四节 本研究的目的意义和主要内容33-35
• 第二篇 试验研究35-89
• 第一章 研究瘤胃产甲烷古菌分子多样性的引物筛选35-50
• 1 材料与方法37-39
• 2 结果39-45
• 3 讨论45-49
• 英文摘要49-50
• 第二章 产甲烷古菌在瘤胃中的生态分布研究50-66
• 1 材料与方法51-52
• 2 结果52-60
• 3 讨论60-65
• 英文摘要65-66
• 第三章 瘤胃与盲肠中产甲烷古菌的比较研究66-77
• 1 材料与方法67
• 2 结果67-72
• 3 讨论72-76
• 英文摘要76-77
• 第四章 山羊瘤胃产甲烷古菌的分子多样性研究77-89
• 1 材料与方法78-79
• 2 结果79-85
• 3 讨论85-88
• 英文摘要88-89
• 全文结论89-90
• 全文创新90-91
• 参考文献91-102
• 致谢102-103
• 攻读学位期间发表的学术论文103

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