flaB重组干酪乳杆菌口服疫苗可增强鲤鱼对气单胞菌的免疫能力

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文章背景简介

BACKGROUND INTRODUCTION

气单胞菌属是人类、动物和水生生物极其重要的传染性病原体。该病原菌广泛存在于水生环境中，多数菌株具有较高的致病性，可引起水生动物疾病、导致水产养殖业巨大的损失。此外，气单胞菌还会引起人类腹泻，且目前病例也日渐增加，对公共卫生安全产生了严重的问题。疫苗接种被认为是预防感染的有效策略。

气单胞菌的毒力因子，主要包括脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMPs）、气溶酶（Aer）、鞭毛蛋白（Fla）等。其中，鞭毛蛋白（fla）是细菌鞭毛的主要成分，主要包括flaA和flaB，具有良好的免疫原性，可作为血清学鉴定的基础。鞭毛蛋白（FlaB）是气单胞菌的多种毒力因子之一，可以作为一种良好的免疫抗原，可单独免疫宿主，在免疫应答中发挥重要作用，具有广阔的发展前景。

黏膜是外来病原体与鱼类接触时遇到的第一道屏障，而鱼会通过局部免疫反应对机体产生保护作用。与传统免疫相比，黏膜免疫会产生高水平的抗体，强烈激活宿主T细胞和应激反应。特别是粘膜免疫非常适合于动物间大规模传染病的预防。因此，基于黏膜免疫制备的口服疫苗是治疗鱼类气单胞菌感染等水生疾病的合适方法。采用黏膜免疫法制备的鱼类口服疫苗比传统的注射疫苗更具优势。

乳酸菌作为黏膜免疫的良好蛋白传递载体，能够诱导机体产生有效的免疫应答和免疫耐受，被广泛认为是能够抵抗肠道不良环境并完成定植和抗原呈现的疫苗载体。吉林农业大学动物科学技术学院和河北科技师范大学预防兽医学省级重点实验室的Yi－Di Kong，Yuan－Huan Kang等人2019年在《Fish and Shellfish Immunology》杂志上（IF 2018＝3．185，农林科学1区）发表了题为“Oral immunization with recombinant Lactobacillus casei expressing flab confers protection against Aeromonas veronii challenge in common carp，Cyprinus carpio”的文章。在本文中，作者研究开发了两种木糖诱导表达系统表达气单胞菌flaB的干酪乳杆菌菌株，并以免疫原性作为疫苗载体诱导鱼对气单胞菌的免疫应答。

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所用到的主要方法

METHODS

1．质粒构建及蛋白表达

2．Western blot

3．免疫荧光分析

4．ELISA

5．白细胞吞噬作用分析

6．qRT－PCR

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文章主要内容摘要

ABSTRACT

用SmaI／EcoRV或BamHI／XhoI限制性内切核酸酶消化flaB基因（900 bp）的纯化PCR产物，分别插入pPG－1或pPG－2表达载体的相应位点，得到pPG－1－flaB或pPG－2－flaB。重组的pPG－1－ flab和pPG－2－ flab经电穿孔转化入干酪乳杆菌（Lactobacillus casei ）CC16，同时采用不含flaB基因（Lc－pPG）的pPG质粒的干酪乳杆菌作为载体对照。实验首先采用Western blot分析及免疫荧光对重组flaB基因在干酪乳杆菌菌株中的表达情况进行了分析检测。此外，利用PCR和测序技术筛选重组干酪乳杆菌，并分析了细胞的生长和遗传稳定性，结果发现重组质粒可以稳定遗传超过50代，外源抗原的表达和分泌对宿主菌细胞生长基本上没有太大的影响。在口服重组干酪乳杆菌Lc－pPG－1－flaB和Lc－pPG－2－flaB免疫鲤鱼后，鱼体内ACP、AKP、LZM、SOD活性增加，血清免疫指标增强，免疫组织中IL– 10、IL－β、IFN－γ和TNF－α的表达增加。在肠道中能够检测到重组干酪乳杆菌的存活，并且，在用病原菌维隆气单胞菌（Aeromonas veronii）攻击宿主时，给予Lc－pPG－1－flaB（66．7％）和Lc－pPG－2－flaB（53．3％）免疫组的存活率均明显高于对照组。

这些结果表明：flaB重组干酪乳杆菌可以定植到鲤鱼的肠道，并促进免疫应答、增强鲤鱼对气单胞菌感染的抗病性，从而产生较强的免疫保护作用。

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