肿瘤免疫中的CD8+T细胞耗竭

T细胞耗竭是一个笼统的术语，泛指抗原特异性CD8＋T淋巴细胞存在的所有丧失功能的状态，这种现象最早在人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的患者中观察到，这些细胞持续存在，但无法清除致病性威胁。阻断耗竭的CD8＋T细胞（CD8＋Tex）表面共抑制受体，如程序性死亡受体1（PD－1），可以重新激活T细胞的细胞溶解作用。

在癌症中，CD8＋Tex对肿瘤细胞同样反应低下。这些丧失功能的CD8＋Tex表达高水平的PD－1，主要存在于肿瘤微环境（TME）中，通过检查点阻断剂（ICB）的作用可以将这些表达PD－1的细胞从无反应、耗竭状态中拯救出来。

然而，目前对CD8＋T ex的理解正在发生转变。最新的单细胞转录组学和全基因组表观遗传学研究进展对这一观点提出了挑战，关于CD8＋Tex的空间分布、异质性以及ICB对它们的作用，已经有了新的见解。我们现在知道PD－1的表达并不是细胞功能障碍和衰老的绝对指标，相反，PD－1的表达强度反映了CD8＋Tex的复杂异质性。最新的数据表明CD8＋Tex是一个发育连续体，其中谱系由干细胞样PD－1loCD8＋Tex前体祖细胞到终末功能失调的PD－1hiCD8＋Tex。在癌症中，这些CD8＋Tex亚群在正常外周组织和肿瘤组织中的分布不均匀，并且对ICB的反应不同。

T细胞耗竭与抗原的持续作用

T细胞耗竭与抗原的持续驱动作用息息相关。在急性感染的状态下，幼稚的CD8＋T细胞分化为短命效应细胞（SLEC）或记忆前体效应细胞（MPEC）。在抗原清除后，大多数SLEC死亡，而MPEC存活形成记忆性CD8＋T细胞，形成长期保护性免疫。

而在慢性感染下，观察到高亲和力抗原特异性的CD8＋T细胞分化为SLEC迅速清除，死亡，但没有形成MPEC亚群。相反，针对低抗原亲和力的CD8＋T细胞扩增、耗竭，表现为增殖、细胞毒性和细胞因子产生的显著减少，并在对抗持久性抗原的僵持中死亡。

慢性病毒感染和癌症的一个共同特征就是，两者都是以抗原的持久性作用为特征的长期疾病。针对肿瘤抗原的幼稚CD8＋T细胞首先在外周淋巴组织启动，产生足有自我更新特性的干细胞样PD－1loCD8＋T细胞，在趋化因子CCL5和CXCL9的作用下，向TME迁移并形成具有效应作用的PD－1loCD8＋Tex。然而，TME中持续的抗原负荷最终迫使这些细胞持续分化为丧失功能的PD－1hiCD8＋Tex。PD－1hi状态伴随着协同抑制受体表达的增强（包括Tim－3、LAG－3、CD160、2B4、TIGIT和CTLA－4）以及效应器功能的逐渐丧失。一旦CD8＋Tex进入PD－1hi状态，表观遗传会强制阻止去分化回到功能性干细胞样和效应器样PD－1lo状态。ICB（例如，抗PD－1）促进的抗肿瘤反应仅来自淋巴或肿瘤内PD－1loCD8＋Tex亚群的扩增，功能低下、ICB抵抗的PD－1hiCD8＋Tex最终会凋亡。

肿瘤和慢性病毒特异性CD8＋T细胞都具有与TCR信号相关基因的显著富集（Batf、Egr2、Ezh2、Irf4、Nfatc1、Nfatc2、Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3）。这一观察结果进一步证实了抗原的持久性参与是耗竭的主要驱动因素。

免疫检查点抑制剂的经验

耗竭的开始伴随着共抑制受体的表面表达，共抑制受体控制着CD8＋T细胞的功能。这些免疫检查点，包括PD－1，进一步抑制T细胞活化，防止过度的不良炎症和自身免疫事件。在针对病毒的研究中，人们首次发现PD－（L）1的ICB可使CD8＋Tex恢复活力。重要的是，反应的恢复源于PD－1＋CD8＋Tex，而不是从头开始的PD－1?CD8＋T细胞启动。这项早期研究提出了这样一个观点，即CD8＋Tex的重新激活实际上是耗竭“逆转”的同义词。此时，ICB迅速进入临床，并建立了癌症治疗的新模式，在有限的患者群体中产生了持久的反应。尽管ICB早期取得了成功，但ICB背后的作用机制仍然难以捉摸。

进一步的研究发现， PD－1＋CD8＋Tex可进一步分为PD－1lo和PD－1hi亚群。由此产生了一个假设，即PD－1lo细胞随着CD8＋T细胞的耗竭而分化为PD－1hi亚群。在这一理论中，复苏并不等同于衰竭的逆转，即由PD－1hi转变为PD－1lo或PD－1－。有益的反应完全来自于动员未完全耗竭的PD－1lo细胞，而不是PD－1hi终末衰竭的T细胞。体外研究表明，将抗原特异性的PD－1lo和PD－1hi分选细胞转移到小鼠体内后，在有无抗PD－L1的情况下用抗原再次激发，结果表明，只有PD－1loCD8＋Tex能够对ICB产生反应。

PD－1hi亚群与随后其他共抑制受体的表达相关，包括Tim－3、LAG－3、CD160、2B4， CTLA－4以及TIGIT，其中具有共抑制受体高表达的细胞显得更加耗竭。

MEK抑制剂

RAS／RAF／MEK／ERK有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）级联反应与PC的发病机制密切相关，尤其是在含有RAS或BRAF突变的肿瘤中。

Trametinib是一种口服的选择性丝裂原／细胞外信号相关激酶（MEK）1／2酪氨酸激酶抑制剂，在1期临床试验中，作为PC的单一疗法显示出适度的抗肿瘤活性。随后，在一项随机II期临床试验中，将其与吉西他滨的联合治疗与吉西他滨单药治疗进行了比较，然而，两组患者在中位OS、PFS和ORR方面没有差异。另一种MEK1／2抑制剂pimasertib的结果也令人失望。

在可能的耐药机制中，表皮生长因子受体（EGFR）过度激活，通过反馈激活AKT－PI3K途径阻止细胞凋亡，这个概念产生了对MEK和EGFR进行双重阻断的想法。一项单臂II期试验在46名经多次治疗的晚期PC患者中测试了EGFR抑制剂erlotinib和MEK抑制剂selumetinib的联合作用。然而，效果甚微，没有客观响应，仅有41％的患者SD持续时间≥ 6周，和癌胚抗原（CEA）水平下降（38％）。

在本试验失败后，在一项II期试验中，双阻断策略集中在MEK和AKT下游的靶点上，该试验使用selumetinib联合MK－2206（一种选择性泛AKT抑制剂）或改良FOLFOX（奥沙利铂和氟尿嘧啶）在转移性化疗难治性PC患者中进行评估。同样，联合治疗没有显示出预期的疗效，实验组的中位OS和PFS比对照组更短。

EGFR抑制剂

EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，EGFR的过度表达经常发生在晚期PC中。EGFR的突变是非小细胞肺癌的预测因素，但同样的状态是否在PC中存在尚不清楚。在一项III期临床试验中，在569例晚期PC患者中检测了吉西他滨联合EGFR抑制剂erlotinib的效果。联合给药组的中位OS（6．24个月vs 5．91个月；HR0．82；CI 95％ 0．69－0．99；p＝0．038）和PFS（3．75个月vs 3．55个月；HR 0．77；CI 95％ 0．64－0．92；p＝0．004）都略有延长，但是具有显著性差异。

为了探索erlotinib的进一步效果，III期LAP07临床试验招募了449名晚期PC患者，在之前的随机阶段接受化疗或放化疗，然后单独使用吉西他滨或与erlotinib联合治疗。结果令人失望，两组之间没有差异，导致中期分析无效而中止试验。

随后的一项试验分析了吉西他滨和erlotinib联合治疗在88例转移性PC患者中的疗效，这些患者中包含EGFR的突变患者，突变涉及外显子20（50％）、外显子19（37％）、外显子21（10％）和外显子18（3％）。相比单纯化疗组，联合给药组无论是在中位PFS（3．8个月vs．2．4个月；p＜0．001）或OS（7．2个月对4．4个月；p＜0．001）方面都有改善。携带EGFR突变的患者从联合治疗中获益最大，相比EGFR野生型患者，中位PFS（5．9个月vs 2．4个月；p＝0．004）和OS（8．7个月 vs 6．0个月；p＝0．044）更长。最常见的突变是外显子20中的L778P，占所有突变的24％。

此外，对于EGFR的单克隆抗体，最近的一项荟萃分析评估了四项在晚期PC患者中测试cetuximab的随机对照试验，结果与对照组相比，在OS、PFS和ORR方面均没有显著差异。

另一种EGFR靶向人源化单克隆抗体nimotuzumab与吉西他滨在18例晚期PC患者的一线治疗进行了测试。结果ORR为11．1％，DCR为55．6％，中位PFS和OS分别为3．71个月和9．29个月。最近，在一项双臂的临床IIb期试验中（NCT00561990），在186名晚期KRAS野生型PC患者中，nimotuzumab和吉西他滨联合给药作为一线治疗提高了1年生存期的比率（34％ vs 19％，HR 0．69；P＝0．03）。

KRAS靶向制剂

Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）是RAS家族蛋白的一种亚型，是一种具有GTPase活性的小细胞质蛋白。KRAS是PC中最常见的基因组改变，占90％以上的病例。激活该癌基因的突变可促进细胞生长、增殖和存活，并在致癌过程中具有重要作用。98％的KRAS突变发生在外显子2（密码子12），G12D和G12V是最常见的突变，其次是G12A／C／S（各2％）和G12L／F（＜1％）。

由于KRAS突变在PC中的普遍性，靶向KRAS或其下游通路可能在PC中至关重要。然而，开发有效的KRAS抑制剂是肿瘤学研究中最具挑战性的目标之一。令人鼓舞的是，最近已开发出几种结合KRAS的小分子（例如Sotorasib、Adagrasib）在各种癌症类型中显示出良好的抗肿瘤作用。这给一小部分携带G12C突变的PC患者带来希望。

目前，有多个正在进行的临床试验，正在评估针对KRAS突变的PC的多种策略。

靶向肿瘤微环境

PC具有独特的肿瘤微环境，其特征是存在致密和异质性基质，主要由具有不同功能的细胞组成，如成纤维细胞、肌成纤维细胞、免疫细胞和胰腺星状细胞、血管、细胞外基质和可溶性蛋白质。这些成分共同促进肿瘤生长和转移扩散，并在肿瘤血管内施加高静压力，这可能限制细胞运输，特别是免疫细胞的运输。因此，靶向肿瘤微环境可能是克服耐药性和促进PC免疫浸润的有效策略。

Hedgehog（Hh）信号是胚胎发生过程中的一个重要途径。它由Sonic Hh（SHh）、IndianHh和Desert Hh、受体蛋白PTCH 1、PTCH 2和SMO以及转录因子（Gli1、Gli2和Gli3）组成。Hh途径在PC的发生中起着关键作用。Hh信号的维持有利于异常增殖，而SHh激活胰腺星状细胞，通过产生细胞因子、趋化因子、生长因子和过量的细胞外基质促进结缔组织增生和缺氧微环境。由此产生的微环境有利于肿瘤的发生和发展，以及肿瘤的侵袭、转移、免疫逃逸和治疗抵抗。

在一项Ib／II期试验中，对SMO拮抗剂Vismodegib与吉西他滨联合应用进行了评估，纳入了106名先前未经治疗的PC患者，但与安慰剂相比，其未能改善化疗药物的疗效。

此外，另一种SMO拮抗剂saridegib在1期试验中与5－氟尿嘧啶、亚叶酸钙、伊立替康和奥沙利铂（FOLFIRINOX）联合使用，随后在2期试验中与吉西他滨联合使用，这两项试验均在先前未经治疗的晚期PC患者中进行。尽管I期试验报告了抗肿瘤活性和可接受安全性的早期证据，但在II期研究中显示出实验药物的有害影响，导致在初步分析后中止试验。

聚乙二醇透明质酸酶α（PEGFH20）在临床前的动物模型中被证明可以在TME中降解透明质酸，从而增加对癌细胞的药物输送。在一项II期试验中研究了PEGPH20，该试验纳入了279名先前未经治疗的PC患者，随机分为蛋白结合型紫杉醇和吉西他滨（含或不含PEGPH20）。实验组中位PFS显著增长（p＝0．049），ORR提高（45％ vs 31％），但没有记录OS的益处。

TGF－β是PC的另一个潜在靶点，因为其能够促进细胞生长、上皮细胞向间充质细胞转化、细胞外基质重塑和免疫抑制。Galunisertib是一种I型TGF－β受体抑制剂，在Ib／II期试验中与吉西他滨联合使用，作为晚期PC的一线治疗。在II期部分，156名患者被随机分为两组，一组接受Galunisertib治疗，另一组接受安慰剂治疗。中位OS在安慰剂组为7．1个月，在galunisertib组为8．9个月，药物耐受性良好。

JAK／STAT抑制剂

Janus激酶／信号转导子和转录激活子（JAK／STAT）途径参与多种分子的信号转导，包括细胞因子、白细胞介素和生长因子。人类有四个JAK家族成员（JAK1、JAK2、JAK3和TYK2）和七个STAT家族成员（STAT1－4、STAT5A、STAT5B和STAT6）。JAK／STAT通路在癌症中经常发生变化，主要是由于STAT3和STAT5A／B的上调，在细胞增殖、凋亡、代谢变化、EMT和促进免疫抑制反应中起着重要作用。

口服STAT3抑制剂Napabucasin在一项Ib／II期试验中表现出良好的活性，该试验纳入了59名转移性PC患者，与蛋白结合型紫杉醇和吉西他滨联合使用。DCR为78％，包括2个CR（3．4％）和26个PR（44．1％）。PFS和OS的中位数分别为7．1个月和9．6个月。在50名可评估患者中，DCR为92．0％，ORR为56％，未发生剂量限制性不良事件。

基于这些结果，后续又开始一项随机III期研究，评估纳Napabucasin联合蛋白结合型紫杉醇和吉西他滨作为转移性PC患者一线治疗的疗效和安全性。不幸的是，经过中期分析后，试验因无效而终止。

Ruxolitinib是一种JAK1／2抑制剂，在两项随机III期试验中与卡培他滨联合使用，在一线治疗后出现疾病进展的晚期PC患者中进行试验。在进行中期分析后，该研究再次因无效而终止。目前，还有JAK1抑制剂itacitinib正在与pembrolizumab联合用于晚期实体瘤（包括PC）的评估中。  

NTRK抑制剂

原肌球蛋白受体激酶（TRK）家族包括三种跨膜蛋白受体（TrkA、TrkB和TrkC，分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码），它们调节神经元发育和功能的许多方面。涉及NTRK1／2／3基因的染色体易位导致TRK激酶的组成性激活和异常表达。

最近，针对NTRK融合阳性肿瘤的特异性靶向治疗已经出现。Larotretinib是一种高选择性口服TRK抑制剂，在3项单臂临床试验中进行了测试，共纳入55名TRK融合阳性癌症患者。结果令人鼓舞；ORR为75％，1年后仍有71％的持续应答和55％的无进展患者。唯一的一名PC患者达到PR，DOR和PFS未达到。

基于这些结果，2018年11月，FDA批准Larotretinib用于治疗NTRK融合阳性肿瘤的成人和儿童患者。  

靶向肿瘤代谢

癌细胞表现出大量的代谢修饰，例如pH稳态的改变以及离子转运系统的相关修饰，这可能是治疗的潜在靶点。在PC中，驱动细胞生长的基因突变，如KRAS，已被证明会改变代谢途径。

Devimistat是丙酮酸脱氢酶和α－酮戊二酸脱氢酶的选择性抑制剂，这两种酶是肿瘤细胞三羧酸循环的关键酶。三羧酸代表了对DNA损伤剂的抗性来源，因此，使用devimistat可能增强肿瘤对化疗药物（如铂衍生物）的敏感性。一项I期试验测试了devimistat和改良FOLFIRINOX联合应用在转移性PC患者中的疗效和安全性，ORR为61％，包括3个CRs。基于这些结果，目前正在对转移性PC患者进行改良FOLFIRINOX联合devimistat的III期试验。

羟基氯喹作为一种潜在的抗肿瘤药物来源于其对细胞自噬的抑制作用。细胞自噬可以通过细胞内细胞器的分解代谢支持肿瘤后期生长，为肿瘤增殖提供营养。一项II期试验将羟基氯喹作为单药治疗转移性PC患者，但未能证明抗肿瘤活性。

另外一项II期试验评估了将羟基氯喹加入吉西他滨／蛋白结合型紫杉醇作为晚期PC患者的一线治疗。该研究未能证明羟基氯喹对OS的益处，但与单纯化疗相比，实验组的ORR显著提高（38．2％ vs 21．1％，p＝0．047）。

最近，一项II期研究探索了在吉西他滨／蛋白结合型紫杉醇中加入大剂量羟基氯喹作为可切除PC患者的术前治疗。该研究证明，与单纯化疗组相比，羟基氯喹加化疗组的病理性肿瘤反应显著改善（p＝0．00016）。目前，还有一些试验正在进行中，目的是评估羟基氯喹在PC中不同组合的疗效。

免疫疗法

众所周知，PC对免疫治疗无效，主要是由于免疫抑制性TME，其特征是缺乏高质量的肿瘤浸润效应T细胞以及作为免疫细胞浸润屏障的异质致密基质。                  

目前，PC免疫治疗的唯一潜在目标人群是微卫星高不稳定性（MSI－H）肿瘤患者亚群，其中免疫检查点抑制剂pembrolizumab显示了令人满意的ORR。然而，该亚组仅代表一小部分（小于1％）PC患者。

在一项II期试验中，评估了抗CTLA－4单抗ipilimumab对27例局部晚期或转移性PC患者的疗效，但没有任何生存益处。最近的一项II期试验评估了使用抗CTLA4和抗PD－L1药物的双重免疫检查点阻断策略，同样没有令人鼓舞的结果。随后在一项Ib／II期试验中评估了使用标准化疗（吉西他滨加蛋白结合型紫杉醇）并添加PD－1抑制剂pembrolizumab的联合策略，中位OS和PFS分别为9．1个月和15．0个月，但试验未达到其主要终点，即＞15％的CR率。最近一项II期试验评估了双重免疫检查点阻断联合一线化疗，接受durvalumab联合tremelimumab结合标准化疗，不幸的是，免疫检查点抑制剂的添加并未导致OS、PFS或ORR中位数的显著改善。

ICI与肿瘤疫苗的结合也正在探索中。GVAX是一种全细胞疫苗，由辐照过的异基因PC细胞组成，通过基因工程可分泌粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子，似乎可将肿瘤从非免疫原性转化为免疫原性。此外，其给药导致免疫检查点分子（如PD－1和PD－L1）的上调，表明其与ICI的潜在协同作用。在一项II期试验中，与单独使用ipilimumab相比，ipilimumab加GVAX似乎在中位OS方面产生了益处，尽管没有达到统计学意义。

Algenpantucel－L是一种异基因PC疫苗，由两个人类PDAC细胞系（HAPa－1和HAPa－2）组成，通过使用逆转录病毒转移小鼠αGT基因以表达α半乳糖。Algenpantucel－L作为化疗和放疗的辅助治疗在70例PC切除患者中进行了测试，algenpantucel－L的加入改善了无病生存率（DFS）和OS。然而，后续的III期试验并未证实先前的发现。

吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）是一种色氨酸分解代谢酶，在外周免疫耐受的正常调节以及免疫治疗抵抗机制中起着关键作用。一项I期研究表明，IDO抑制剂indoximod与吉西他滨／蛋白结合型紫杉醇联合化疗具有良好的抗肿瘤活性。33例转移性PC患者的ORR为37％（包括1 例CR）。

趋化因子及其受体CCL2／ CCR2轴驱动肿瘤微环境中的趋化抗性和免疫抑制机制。因此，CCR2阻断可能是一种有希望的PC免疫治疗策略。PF－04136309是一种CCR2抑制剂，与FOLFIRINOX联合应用于边缘可切除和局部晚期PC患者，ORR达到49％。最近，一项Ib期研究在21名先前未经治疗的晚期PC患者中测试了PF－04136309与标准化疗的联合作用。然而，抗肿瘤活性与单纯化疗获得的活性相似（ORR 23．8％），并且观察到相对较高（24％）的肺毒性，这引起了对这种联合用药安全性的担忧。

目前，有多个正在进行的临床试验，正在评估免疫疗法治疗PC的多种策略。

小结

与其他类型的肿瘤相比，胰腺癌的治疗进展很少，目前化疗仍然是治疗的主要手段。对BRCA突变体PC的Olaparib维持治疗的批准代表了对此类顽固性疾病进行个性化治疗的一项令人鼓舞的成就，并为研究具有与PARPi潜在协同作用的各种药物打开了大门，包括免疫治疗和酪氨酸激酶抑制剂。

新药物的出现，包括用于NTRK融合阳性肿瘤的NTRK抑制剂或用于MSI－H肿瘤的pembrolizumab等与肿瘤类型无关的疗法，保证了通过实施基因检测在不同PC患者亚群中寻找新的治疗方案。PC的分子异质性可能要求根据个体肿瘤特征采取多种多样的治疗方法。

总之，尽管过去有许多令人失望的结果，但一些研究性治疗已经展现出可应用的前景，这些代表了PC个性化药物未来的坚实希望。

参考文献：

1．Hacking Pancreatic Cancer：Present and Future of Personalized Medicine． Pharmaceuticals （basel）． 2021Jul； 14（7）： 677．