CAR-T针对实体瘤的挑战与开发策略

前言

现代免疫疗法作为癌症治疗的一个新里程碑，带来了革命性的改变，以前由于缺乏治疗选择而受到限制的许多肿瘤类型得到了改善。这反映在随后的一系列免疫肿瘤学（IO）药物的获批。在实体瘤中，大多数成功的案例都是通过免疫检查点抑制剂（ICIs）实现的，但其他的免疫疗法仍在开发中。一种很有前途的方法是通过肿瘤靶细胞抗原和T细胞表面分子的同时作用，使T细胞重新定向和募集，从而激活多克隆细胞毒性T细胞，并最终导致肿瘤溶解。这种新概念的T细胞接合器（TCE）包括基因工程过继细胞疗法（GE－ACT）和双特异性抗体（BsAb）。

过继细胞疗法包括给予病人自己的免疫细胞，这些细胞已经在体外用改良的T细胞受体（TCR）或嵌合抗原受体（CAR）进行了修饰。双特异性抗体是由两个相互连接的抗体结合区组成的重组蛋白，能够同时识别两个抗原，一个位于肿瘤细胞表面，另一个抗原是TCR的共同组成部分，充当肿瘤和T细胞的桥接剂，并使TCR触发靶向T细胞定向攻击肿瘤细胞。

TCE在一些血液学癌症中显示出了极好的效果，到目前为止，已经有三种CD19靶向TCE，两种CAR－T细胞和一种BsAb，由食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局批准。然而，实体瘤有完全不同的分子、物理和环境障碍，尤其是缺乏真正特异的表面肿瘤抗原，使TCE在实体瘤上的应用面临极大挑战。

TCEs的作用机制

TCEs的活性主要取决于TCR激活的不同策略。天然TCR／分化簇3（CD3）是一种八聚体蛋白复合物，由具有固定化学计量比的异二聚体和同二聚体组成：CD3γ／CD3ε、CD3δ／CDε、CD3ζ／CD3ζ和CD3α／CD3β，CD3α／CD3β负责识别由主要组织相容性复合体（MHC）递呈的多肽片段，而其余单位将通过免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）促进级联激活，从而导致细胞毒性颗粒酶和穿孔素释放，以及不同的细胞因子和趋化因子，导致额外的T细胞募集和增殖。

大多数BsAb通过抗体结合区同时连接肿瘤细胞抗原和TCR的CD3ε亚基，从而绕过MHC限制，促进细胞毒性。BsAb可分为两个亚型：不含Fc结构域的小片段形式和免疫球蛋白G（IgG）样BsAb。大多数类似IgG的BsAb含有一个工程化的Fc结构域，旨在维持Fc受体（FcRn）的结合，以提高其半衰期和稳定性。

基因工程化的TCR将肿瘤相关抗原（TAA）识别为天然的生物途径，即通过CD3α／CD3β激活，因此需要MHC呈递。TCR－T对细胞内和膜表面抗原都能被识别，这使得靶点范围更广。CAR－T细胞不依赖于MHC；其嵌合结构包含一个单链可变片段（scFv）作为抗原结合的胞外结构域，其中一个铰链区、一个跨膜区和一个负责T细胞活化的胞内CD3ζ链。新一代的CAR－T不仅包括激活域，还包括共刺激分子和细胞因子表达。总之，BsAb和CAR－T细胞CD3的激活依赖于抗体结合区介导的抗原识别，而TCR－T细胞则需要肿瘤抗原的MHC呈递才能被激活。

TCE在实体瘤治疗中的临床表现

TCEs的抗肿瘤活性：

TCEs的临床发展是一个不断挑战实体瘤的过程。2006年，MART－1 TCR－T细胞对黑色素瘤患者显示出良好的耐受性，并且在两名患者中观察到工程细胞的持续存在和疾病的客观响应，人们因此对GE－ACTs的期望上升。几年后，catumaxomab在欧盟被批准用于治疗恶性腹水。这种CD3抗EpCAM的三功能抗体在II／III期试验中得到证实，以减少穿刺的需要。然而，2017年因商业原因撤回了该药。2010年，CD19导向CAR－T细胞首次成功用于急性淋巴细胞白血病（ALL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL），并同时促进了针对实体瘤的研究。不幸的是，在这一领域，很快观察到一个临床的黑暗面，多个试验不得不停止招募，因为致命的毒性和缺乏足够的抗肿瘤活性。人们因此将临床研究转向更好和更具体的目标，导致第二波TCE的研究浪潮，并取得了更好的结果。

在神经母细胞瘤中，直接靶向GD2神经节苷脂的下一代CAR－T细胞显示出3个患者的完全反应。同样，HER2表达肉瘤的I／II期试验发现HER2－CAR－T细胞具有临床疗效，耐受性良好。另外两个CAR－T细胞也显示出令人鼓舞的结果；在间皮瘤患者中，经胸膜内注射导向间皮细胞的CAR－T的客观反应率为41％。有趣的是，这些患者的外周血中也检测到CAR－T细胞。第二个为自体CAR－CLDN18．2－T细胞治疗CLDN 18．2阳性胃或胰腺肿瘤，其反应率为36％。

2017年，第一个转基因NY－ESO TCR－T细胞在滑膜肉瘤患者中的响应率高达50％，并且CRS可控。NY－ESOTCR－T细胞同样在脂肪肉瘤患者中也达到了50％的响应率（4／8）。2019年，MAGE－A4 TCR－T细胞在晚期滑膜肉瘤患者中也报告了类似的响应率。

最近，另外两个TCR－T早期试验报告了富有前景的结果。一个靶点是人乳头瘤病毒（HPV）阳性相关上皮癌的E7肿瘤蛋白。在此项研究的12名重度治疗的患者中，有6名在研究的三个剂量水平上获得持久的部分响应。另一种是ADPA2M4 SPEAR TCR－T细胞治疗MAGE－A4阳性肿瘤，在治疗的38例患者中，疾病控制率约为90％，确定的44％的部分响应在滑膜肉瘤、肺癌、头颈癌等肿瘤中均有报道。大多数毒性与淋巴细胞衰竭有关，但两例患者发生致命后果。

关于BsAb，2014年，blinatumomab成为第一个被FDA批准的BsAb，目前用于治疗ALL患者。同时，cibisatamab作为单药或联合atezolizumab治疗微卫星稳定性大肠癌患者的I期研究结果显示，有效率分别为6％和18％。安进目前正在开发两种半衰期延长的BsAb，AMG199用于MUC17阳性胃和胃食管交界处肿瘤，AMG757用于DLL3阳性小细胞肺癌。此外，有各种各样的临床试验在不同的适应症下进行。

T细胞驱动的毒性：

TCEs可能导致多种不同的毒性。T细胞输注前给予氟达拉滨和环磷酰胺的淋巴衰竭化疗，随后导致全血细胞减少和潜在的发热性中性粒细胞减少症，并报告了一些致命病例。

细胞因子释放综合征（CRS）是一种与TCE相关的不良事件（AE），大多为抗原依赖性的，表现为大量释放促炎性细胞因子（IL－6、TNF－α、IFN－γ、IL－1）和炎症标志物（铁蛋白、C－反应蛋白）的反应性增加，类似于脓毒血症。患者出现发热、肌痛、心动过速、低血压、呼吸功能不全等症状，并可能导致死亡。循环中的细胞因子和趋化因子也能激活单核细胞和巨噬细胞，能够跨越血脑屏障。

GE－ACTs也与免疫效应器细胞相关神经毒性综合征（ICANS）有关，其定义为意识下降、意识混乱、癫痫发作和脑水肿，并不总是与全身性CRS一起出现。blinatumomab是一种CD3－CD19双特异性T细胞接合器（BiTE），与临床上无法与ICANS区分的神经学AEs相关，并且与CRS的快速甚至有时致命的发展有关。使用cibisatamab，CEA－CD3的BsAb治疗结直肠癌（CRC），高达24％的患者出现与CRS类似症状一致的严重输液相关反应（IRR）。

一般来说，CRS的严重程度可能与肿瘤负荷、注入的细胞数量或BsAb的起始剂量有关。逆转这些症状的治疗方法包括中和IL－6活性的解毒剂，Tocilizumab已经被FDA批准用于治疗CRS，而siltuximab还没有得到充分的研究，其用途仍处于研究阶段。此外，这些治疗通常与皮质类固醇联合使用，有时还与其他免疫抑制剂联合使用，如抗肿瘤坏死因子α（infliximab）或抗IL－1（anakinra）。

此外，TAA也在健康组织中表达，当T细胞与非肿瘤细胞结合时，可能会出现“靶向非肿瘤”的毒性。例如，在MART－1和gp100的TCR－T治疗黑色素瘤的研究中，这一现象导致严重皮疹、葡萄膜炎和耳毒性。

面临的挑战和有待改进的区域

克服肿瘤对T细胞导向治疗的耐药性

迄今为止，与血液系统恶性肿瘤的一些主要差异决定了TCE在实体瘤中的疗效较低。比如，在实体瘤中很难找到像CD19这样普遍表达的肿瘤标志物，其次治疗需要深入到肿瘤中，并且必须在复杂且具抑制性的肿瘤微环境中工作。这些因素都导致肿瘤对TCE的耐药性。

首先，抗抗体（ADA）可能在TCE输注后出现，由CD4 T淋巴细胞、记忆B细胞和浆细胞介导。药物本身的结构、外来序列的存在、剂量、给药途径和患者的免疫系统都与BsAb治疗后产生的ADA有关，从而导致IRR、治疗效果的潜在降低，并影响清除率以及药代动力学和药效学性质的变化。减少ADA形成的一个有趣的可能性是在BsAb给药之前给予抗CD20抗体，如obinotuzumab，以消除B细胞活性。这一策略目前正在以TCE作为cibisatamab（NTC03866239）的研究中进行探索。

其次，TCE需要恰当地分布。一些试验正在考虑局部给药，如脑（NCT04045847）或间皮瘤，而其他策略包括改善T细胞转运，例如，表达CCL2或VEFGR2趋化因子受体的CAR－T细胞，以实现更好的分布。

第三，当药物到达肿瘤时，异质性存在于所有表型特征；细胞形态、代谢、增殖表达、免疫原性和基因表达，包括细胞表面标记物。确切地说，缺乏真正特异的肿瘤细胞表面抗原，并且可以用这些工程化的T细胞作为靶点，这是对实体瘤的GE－ACTs重定向方法的主要限制。这在B细胞或浆细胞恶性肿瘤中是不同的，在这些恶性肿瘤中，CD19、CD20或BCMA等特异性抗原可以作为靶点，并且可以容忍治疗过程中正常B细胞或浆细胞的耗竭，事实上，一旦治疗结束，药物被清除，这些正常细胞就会从阴性靶向的前体中再生出来。肿瘤内抗原密度的不均一性和肿瘤组织间抗原分布的变化使得精确治疗的靶点难以确定。组合抗原识别方法，如双特异性或三特异性CAR－T细胞，或相反，促进表位扩散或增加抗原表达，可能克服肿瘤异质性。

肿瘤微环境的抑制是TCE失败的另一个主要因素，因此，第四，TCE必须抵抗肿瘤微环境。肿瘤微环境不仅包括免疫抑制细胞，如调节性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞和髓源性抑制细胞，还包括低氧相关因子、坏死、营养缺乏和免疫抑制因子如PD－L1、IL－10或TGF－β。直接作用于成纤维细胞活化蛋白的CAR－T细胞，或表达乙酰肝素酶的CAR－T细胞，分别能创造更有利的环境和提高肿瘤的外显率。对于BsAb来说，理论上，活性将取决于肿瘤周围的T细胞的密度和种类，但它们是不可预测的，而且变化很大。已存在的具有耗竭表型的T细胞，或浸润肿瘤的调节性T细胞可能会阻碍BsAb的作用。

第五，具有完全活力的T细胞需要保持活跃和存活。精氨酸耗竭与增殖、存活和T细胞功能障碍有关。通过CAR基因构建物恢复精氨酸水平可以改善这些功能。T细胞衰竭还与抑制性受体信号上调（即PD－1、TIM－3或LAG－3）以及肿瘤细胞中PD－L1的表达有关。结合TCEs和检查点抑制剂，或T细胞PD－1基因编辑可以重建功能。此外，CAR－T细胞功能障碍与T细胞的非协调性持续激活导致凋亡、衰竭和抗肿瘤效应受损有关，主要与CAR表达的靶点的结构和种类有关。缩短体外扩增方案，或使输注产物在具有干细胞特性的T细胞中富集，可提高T细胞存活率。

最后一点是克服逃避的机制。抗原表达缺失是一种对CAR－T细胞的适应性抵抗机制，常见于恶性血液病和多形性胶质母细胞瘤。BsAb也报导有TAA下调，导致药物活性下降。对于TCR－T细胞，逃避的主要机制是MHC的丢失或下调，这是由于不同的过程造成的，如杂合度的丧失、单个HLA基因的转录抑制、参与抗原处理或呈递的关键基因的表观遗传沉默以及干扰素反应途径。

提高TCE在实体瘤治疗中的有效性

许多不同的策略正在研究以进一步提高TCE的疗效。检查点抑制结合TCEs是一种有趣的方法；CAR－T细胞和PD－L1抑制剂已经在不同的临床试验中成功地进行了研究。临床前研究表明，PD－1抑制也可以通过CRISPR－Cas9技术的基因缺失来实现，包括PD－1的开关受体结构，添加能够将负信号转换为刺激信号的CD28结构域，或者表达缺乏信号结构域的PD－1抑制性受体。此外，与其他免疫检查点的组合可能是一个有趣的途径，包括CTLA－4、LAG－3、TIM－3和IDO，或协同刺激受体4－1BB、OX40、CD40和CD27。

新一代TRUCK CAR－T细胞采用细胞因子调节方法，如IL－12、IL－15、IL－18，可克服免疫抑制的肿瘤微环境。基于患者自身肿瘤新抗原的个性化TCR－T细胞治疗是另一种高度复杂的研究方法。该过程包括新抗原鉴定、TCR克隆、病毒载体或其他技术的组装和验证。然而，这个过程应该用不同的新抗原重复，因为单个突变并不是在所有肿瘤细胞中都表达，这是一个显著的障碍。

联合GE－ACTs和BsAb的新技术也在得到开发，即所谓的双特异性抗体武装的活化T细胞（BAT）。这些BAT具有将旁观者T细胞重新定向到肿瘤细胞的能力，并且在体内具有强大的抗肿瘤活性，因此无需反复输注BsAb。除CD3外的新型BsAb T细胞接合器也在研究中，比如γ－δ T细胞接合器。

提高TCE在实体瘤治疗中的安全性

同时，其他策略也在努力提高TCE的安全性。自杀基因具有控制工程细胞凋亡的能力。单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）正在CAR－T细胞中进行研究，然而，目前尚不清楚HSV－TK是否具有潜在的免疫原性，从而影响T细胞的存活，以及诱导T细胞凋亡的时间是否足以控制患者的毒性。另一种免疫原性较低的方法是诱导性安全开关caspase9（iCasp9），它包含一个与FK506结合蛋白融合的修饰人caspase9。iCasp9的诱导依赖于AP1903的使用，AP1903是一种二聚化的化学诱导剂，它激活caspase分子导致细胞凋亡。

抑制性CARs（iCAR）可用于T细胞，以控制对健康组织的毒性。iCAR由一个对仅在正常细胞中表达的抗原特异性单链抗体组成，具有强大的急性抑制信号，尽管激活受体同时参与，但仍能限制T细胞的激活。

CAR－T和BsAb的结合也可以提高耐受性。例如，CAR被设计成与异硫氰酸荧光素（FITC）结合，而FITC不是靶标，而是一种通用结合，BsAb则将FITC与靶点结合。因此，在没有BsAb的情况下，CAR－T不会被激活，并且可以通过BsAb的剂量进行调节。

最后，组合靶抗原识别是另一种提高耐受性的方法。在这种情况下，T细胞的激活依赖于两个不同CAR的共同激活，一个与CD3转导有关，另一个与共刺激受体CD28或4－1BB有关。对于BsAb，除了肿瘤相关抗原外，目前正在探索针对非CD3 T细胞受体的新一代BsAb，如针对肿瘤PD－L1（NCT03917381）或FAP（EudraCT 2017－000292－83）到4－1BB、LAG－3（NCT0414000）或TIM－3（NCT0375217）的BsAb。

小结

目前，越来越多更好的TCE正在研究中，可能在未来实体肿瘤治疗中发挥重要作用。GE－ACTs和BsAb在其作用机制和耐受性方面有相似之处，但仍有改进的余地，而且在难治性癌症中已有一些令人鼓舞的真正的肿瘤反应。但由于实体瘤的复杂性，许多耐药机制如肿瘤微环境的抑制、肿瘤抗原的异质性或逃避机制等仍有待解决。个性化新抗原导向的TCR－T、双特异性或三特异性CAR－T细胞、BAT或与检查点抑制剂的联合应用已经成为一种有前途的新疗法。从安全性的角度来看，自杀基因的引入、抑制性CARs、CARs与BsAb的结合、靶抗原的组合识别等都是可能改变实体瘤患者未来发展前景的一些新的研究方法。

参考文献：

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2． Next generation chimeric antigen receptor T cells： safetystrategies to overcome toxicity． Mol Cancer． 2019 Aug 20；18（1）：125．

3． clinicaltrials．gov