小药谈肿瘤免疫之Sialoglycans和Siglecs

前言

肿瘤创造了一个局部肿瘤微环境（TME），由不同的细胞类型、细胞外基质成分和支持肿瘤生长和进展的可溶性因子组成。TME通常具有高度的免疫抑制作用，阻止免疫细胞清除癌细胞，从而对癌症免疫治疗产生负面影响。因此，克服免疫抑制性TME对于开发有效的癌症免疫疗法至关重要。

肿瘤细胞在细胞表面表达异常数量的唾液酸，唾液酸是一个带负电的糖分子家族，在糖蛋白和糖脂上覆盖聚糖链。肿瘤细胞上的唾液酸聚糖（sialoglycans）可参与肿瘤细胞－细胞外基质相互作用和肿瘤细胞－细胞间相互作用，它可以形成一种保护区域，以使肿瘤细胞免受免疫识别。事实上，帽状的唾液酸聚糖中带负电的唾液酸部分被认为是造成这种掩蔽效应的原因。用唾液酸酶从TA3小鼠癌细胞表面去除唾液酸后抑制了它们在移植到免疫能力强的小鼠体内的生长。用自体唾液酸酶处理的黑色素瘤和乳腺癌细胞的人类疫苗接种试验表明，去除唾液酸可引起强烈的抗肿瘤免疫反应。过去几十年的研究表明唾液酸聚糖在肿瘤免疫逃避中的作用远远超出了抗原的掩蔽作用，唾液酸是一种有效的免疫调节糖。唾液酸聚糖的许多强免疫调节特性被认为是与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）的特异性相互作用。唾液酸聚糖异常表达的肿瘤细胞可与Siglec家族相互作用以调节TME中的免疫细胞功能。TME似乎能增强肿瘤细胞的异常唾液酸分泌，也能刺激浸润免疫细胞的Siglec表达。这些数据提示癌症中唾液酸聚糖－Siglec轴的失调有助于形成免疫抑制性TME，这是某些癌症逃避免疫治疗的障碍。

sialoglycans的免疫抑制作用

肿瘤唾液酸聚糖与免疫调节之间的联系有待于我们对肿瘤免疫学和TME的理解的进展，以及干扰唾液酸聚糖异常表达的工具的开发。已有的研究已经证明，通过瘤内注射Ac53FaxNeu5Ac（一种选择性唾液聚糖生物合成抑制剂）可以阻断小鼠B16－F10黑色素瘤和9464D神经母细胞瘤肿瘤中唾液酸聚糖的表达，抑制肿瘤生长，并显著改变TME的免疫细胞组成。与对照磷酸盐缓冲液（PBS）治疗的肿瘤相比，TME中唾液酸的去除导致自然杀伤（NK）细胞以及CD4＋和CD8＋T细胞数量增加，调节性T细胞（Treg）和髓系细胞数量减少，从而产生有效免疫应答。还有研究人员将细菌唾液酸酶与抗人表皮生长因子受体（HER）2抗体（曲妥珠单抗）偶联，选择性地从人类HER2＋乳腺癌细胞表面去除唾液酸。与单纯抗HER2或HER2阴性的人乳腺癌细胞相比，人外周血NK细胞通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）更有效地裂解这些抗体－唾液酸酶偶联药物处理的细胞。

另一项研究，研究人员将唾液酸转运体SLC35A1基因沉默，与对照组B16细胞相比，基因沉默的小鼠B16黑色素瘤细胞唾液酸聚糖表达降低，生长速度减少，肿瘤的TME含有更多的效应免疫细胞（NK细胞、CD8＋T细胞）。此外，在小鼠MC38结直肠癌模型中，唾液酸生物合成中的关键酶GNE基因敲除后，与对照肿瘤相比，唾液酸聚糖表达降低，肿瘤生长延迟，CD4＋T细胞、CD8＋T细胞和树突状细胞（dc）的募集增加。此外，肿瘤相关唾液酸聚糖也可能根据肿瘤的分期履行不同的功能。例如，在小鼠（KO细胞）接种肿瘤之前或之后在已建立的肿瘤中（唾液酸阻断剂），唾液酸的减少可能对肿瘤生长和TME成分产生不同的影响。

从另一个角度来看，唾液酸部分的去除会暴露出潜在的聚糖，而这些聚糖又可以被识别或感知，从而影响细胞－细胞之间的交流。例如，暴露在小鼠或人类肿瘤细胞上的半乳糖残基会导致半乳糖残基被半乳糖凝集素识别。人类galectin家族由15个成员组成，它们具有多种生物学功能，包括肿瘤免疫逃避、抑制效应T细胞功能或扩张TME中的调节免疫细胞。

总的来说，上述研究支持肿瘤唾液酸聚糖可能具有强烈的免疫抑制特性，并且至少部分地参与了免疫抑制性TME的形成。此外，肿瘤唾液酸聚糖与TME的相互作用可能是双向的。有证据表明，TME中的因素，如细胞因子或缺氧，可增强肿瘤细胞上唾液酸聚糖的表达，从而促进肿瘤生长和免疫抑制。

Siglecs可抑制TME中的细胞毒效应细胞的功能

自从发现唾液酸识别受体以来，Siglec受体家族被认为是肿瘤唾液酸聚糖调节肿瘤浸润免疫细胞的许多免疫作用的主要靶点。然而，只有最近的研究提供了直接证据，表明唾液酸聚糖－Siglec相互作用确实对效应免疫细胞有很强的免疫调节作用，例如NK细胞和细胞毒性CD8＋T细胞。特别是，人类Siglec－7和Siglec－9的唾液酸聚糖配体已经在一些人类癌症中被发现，包括结直肠癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤。值得注意的是，人类外周血NK细胞表达Siglec－7和Siglec－9，Siglec－7是人类NK细胞的泛标记物，而Siglec－9在CD56dim－CD16＋NK细胞的一个亚型上表达。Siglec－7和Siglec－9与人血NK细胞和人癌细胞上唾液酸聚糖的相互作用抑制了它们溶解这些癌细胞的能力，用唾液酸酶或Siglec阻断抗体治疗增加了它们的杀伤能力。

通过将人Siglec－7结合的唾液酸聚糖聚合物整合到人Jurkat T淋巴细胞的膜中，唾液酸聚糖－Siglec－7相互作用对人NK细胞的细胞毒性的强烈抑制作用也已得到证实。这种免疫抑制效应涉及人Siglec－7中基于酪氨酸的免疫受体抑制基序（ITIM）的磷酸化和SHP－1的募集，后者使下游激活的免疫靶点去磷酸化。抗Siglec抗体阻断唾液酸聚糖－Siglec－7／9相互作用提高了体外人类NK细胞对人类癌细胞的杀伤作用。Siglec－7和Siglec－9在体外对NK细胞介导的细胞毒性的这些主要作用表明，使用靶向抗体－唾液酸酶结合物或糖模拟物从肿瘤细胞中局部清除唾液酸，可以用于促进体内NK细胞介导的肿瘤细胞清除，尽管这需要进行可靠的测试。

人类T淋巴细胞，包括CD8＋T细胞，最初报告不表达或仅表达少量的Siglecs。然而，现在已经证明Siglecs在从非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌、卵巢癌和黑色素瘤患者分离的CD8＋T细胞上大量表达Siglec，其中Siglec－9表达最高。特别是，从非小细胞肺癌肿瘤中分离出的CD8＋效应记忆T细胞在体外扩增后表达了大量的Siglec－9，但在癌症患者和健康献血者的外周血中检测到CD8＋效应记忆T细胞的低表达。这些发现表明Siglec－9的表达是由TME中尚待确定的因子诱导的。因此推测TME中CD8＋T细胞上免疫抑制信号的上调可能有助于减少CD8＋T细胞反应，从而有利于肿瘤免疫逃避。

与人类NK细胞类似，唾液酸聚糖－Siglec－9相互作用可导致体外培养的人CD8＋T细胞ITIM磷酸化和SHP－1募集，从而抑制T细胞受体（TCR）信号和细胞毒性功能。此外，Siglec－9在NSCLC患者浸润性CD8＋T细胞上的表达与生存率降低相关，Siglec－9多态性显示出与发生癌症的风险相关。从非小细胞肺癌患者分离的肿瘤浸润性Siglec－9＋CD8＋T细胞也表达其他抑制性受体，如PD－1、TIM－3和LAG－3。其他最近的研究表明，人类和小鼠的T细胞分别表达Siglec－10（CD4＋T细胞）和Siglec－G和－E（CD3＋T细胞），但它们在TME中的作用尚未被研究。

一个新的概念是，TME中的因子可能诱导CD8＋T细胞亚群以及其他免疫细胞亚群上Siglecs的表达。在TME中识别这些因素和条件应该是未来研究的重点。值得注意的是，在人类效应CD4＋T细胞、CD8＋T细胞和NK细胞上被鉴定出的只有抑制性Siglec，主要是Siglec－7和Siglec－9，但没有激活性Siglecs。这表明淋巴细胞上的Siglecs可能作为糖免疫的“检查点”，肿瘤细胞利用它来抑制效应免疫细胞。

Sialoglycans和Siglecs可调节DC细胞功能

最近，肿瘤唾液酸聚糖－Siglec相互作用被提出通过调节DC细胞的功能来“制动”肿瘤免疫。事实上，DC细胞是免疫系统中的主要抗原呈递细胞（APC），可引起抗原特异性效应T细胞的激活。它们还与其他固有淋巴细胞相互作用，并通过在小鼠和人类体内产生I型干扰素在NK细胞活化中发挥重要作用。DC细胞表达多种抑制性Siglec家族成员，包括Siglec－3、－5、－7和－9（人类DC细胞）和Siglec－E、－G和－H（小鼠DC细胞），被认为影响关键过程，如DC成熟、抗原提呈和激活肿瘤特异性CD8＋T细胞的能力。例如，与野生型小鼠相比，SiglecG缺陷小鼠（C57BL／6J SiglecG–／?）表现出CD8＋DC增强的交叉启动，部分原因是通过增加MHC类肽复合物的形成，从而改善了对皮下B16－F10黑色素瘤生长的控制。此外，小鼠脾脏CD11c＋DC被唾液酸聚糖修饰的OVA抗原（6′－唾液酸－N－乙酰乳糖胺）使OT－II CD4＋T细胞偏向Tregs而不是效应T细胞。在与来自SiglecE–／–C57BL／6J小鼠的DC细胞共培养实验中，未观察到富含唾液酸OVA的树突状细胞诱导活化Treg，这表明Siglec－E参与了这一过程。

这些研究表明，某些肿瘤可以利用唾液酸聚糖－Siglec相互作用在多个水平上调节人和小鼠的DC功能，从而对CD4＋和CD8＋T细胞反应的诱导产生产生负面影响。除了抑制性Siglecs，Siglec－15在人类DC上也被发现，这可能增加了Siglecs对DC的调节水平。因此，分析TME内外不同DC亚群上其他激活和抑制Siglec受体的表达和功能，可能对TME的DC行为有更深入的了解。

Sialoglycans和Siglecs可调节TME中的髓系细胞

髓系细胞是高度可塑性的细胞，可以表现出肿瘤或抗肿瘤功能，这取决于它们所处的环境。TME中的髓系细胞主要由免疫抑制和原发性巨噬细胞、中性粒细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs）组成，这些细胞可以限制有效的抗肿瘤免疫。Siglecs广泛表达于人类骨髓细胞亚群，例如Siglec－3／CD33被用作人类MDSCs的常用标记物。然而，Siglecs在髓系细胞生物学中的作用仍然是未知的。

Siglec－9与肿瘤唾液酸聚糖对结直肠癌细胞的作用，可以诱导SHP－1募集并抑制体外中性粒细胞对肿瘤细胞的杀伤；进一步的体内数据显示，相对于WT小鼠，Siglec－E－／－小鼠中MC38肿瘤的发生和转移灶减少。虽然Siglec－9对中性粒细胞的免疫抑制作用已经确定，但Siglec－9对单核细胞／巨噬细胞极化和功能的影响仍有待研究；人类和小鼠的Siglec－E都是如此。其他报道显示从血液中获得的人类单核细胞和巨噬细胞通过Siglec－9识别携带唾液酸T抗原（一种在多种上皮性人类癌症中经常过度表达的糖蛋白）的O－糖基化粘蛋白1，从而产生原癌细胞因子。然而，最近的三项研究表明，人类Siglec－9不与粘蛋白型O－聚糖结合，而更喜欢糖蛋白上的N－连接聚糖。因此，Siglec－9在髓系细胞上与粘蛋白的关系仍有待阐明。

最近的研究表明，Siglec－10、Siglec－1和Siglec－15调节小鼠和人类肿瘤TME中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的活性。Siglec－10在卵巢癌和乳腺癌患者的TME中由很大比例的人类TAMs表达。它的配体，糖蛋白CD24，在许多人类肿瘤上上调，如卵巢和乳腺，并且可以作为巨噬细胞的“不要吃我的信号”，类似于CD47与SIRPa相互作用。最近的一项研究表明，与对照组相比，人类癌细胞缺失CD24，人巨噬细胞缺失Siglec－10或CD24，或使用单克隆抗体阻断Siglec－10或CD24，可增强人类巨噬细胞的吞噬能力和肿瘤细胞清除率。通过用抗CD24单克隆抗体治疗已建立的人MCF－7荷瘤小鼠，显示了干扰CD24–Siglec－10通路的治疗潜力，与IgG治疗的对照小鼠相比，肿瘤生长减少。

最近，发现在人类乳腺癌中，Siglec－1（CD169）在TAMs上高度上调。除乳腺癌外，在人类结直肠癌和肝细胞癌中也发现了Siglec－1＋巨噬细胞。值得注意的是，在乳腺癌中，Siglec－1是由MHC－II、Fc受体、TLRs和其他跨膜受体组成的新型TAM基因表达特征的一部分，并与乳腺癌患者的较短的疾病特异性生存期相关。Siglec－1不包含已知的细胞内信号基序，但与唾液酸化抗原或病毒颗粒的摄取有关。Siglec－1在乳腺癌TAMs中是否也具有重要的功能尚待研究。

人Siglec－15由TAMs表达，能识别sialyl－Tn抗原，这种抗原在人类癌症中普遍表达。表达sialyl－Tn的H157细胞与人Siglec－15＋巨噬细胞共培养，通过DAP12–Syk途径诱导促癌细胞因子TGF－β。最近，通过高通量分析Jurkat T细胞活化筛选了6500个膜蛋白，Siglec－15蛋白被鉴定为潜在的免疫抑制蛋白。Siglec－15降低Jurkat T细胞活化的程度与已知的T细胞抑制分子程序死亡配体（PD－L）1／2和Fas配体相似。此外，在体外通过抗CD3抗体刺激，Siglec－15抑制人CD8＋和CD4＋T细胞的增殖。随后使用Siglec－15 KO小鼠（C57BL／6 Siglec15－／－）和Siglec－15阻断抗体进行的体内实验表明，存在于TAMs上的Siglec－15抑制抗原特异性CD8＋T细胞反应，并促进免疫抑制性TME。

人类NSCLC肿瘤组织阵列的免疫组化分析显示Siglec－15在CD68＋巨噬细胞、间质细胞和肿瘤细胞本身上均有表达。在人类膀胱癌中，Siglec－15mRNA的表达与一些免疫标志基因（如CD3E、IFNG、GZMA或GZMB）呈负相关。此外，蛋白质序列比较显示Siglec－15的免疫球蛋白可变区和恒定区与B7蛋白家族具有同源性；因此，Siglec－15与CD8＋T细胞的结合是否依赖唾液酸以及是否与B7家族成员一样具有唾液酸独立的免疫调节功能仍有待研究。

总之，这些研究表明Siglec－1、Siglec－10或Siglec－15可能在形成不同的TME中发挥作用。人Siglec－10可能抑制免疫反应，阻断与唾液酸聚糖的相互作用可能有助于提高抗肿瘤活性。然而，抑制性Siglec，如Siglec－10，也将体内健康细胞上的唾液酸聚糖识别为“自身”，并参与免疫调节。同样，人类Siglec－1的表达与阳性和阴性肿瘤参数相关；例如，乳腺癌和结直肠癌患者的Siglec－1＋巨噬细胞与肿瘤进展相关，而在肝细胞癌患者中，它们与更好的临床预后相关。对于Siglec－15，人类和小鼠的促炎功能也已被确认。此外，Siglec－15可以调节同一物种的破骨细胞功能和骨吸收。因此，研究全身性Siglec受体阻断疗法不仅对肿瘤免疫功能的影响，而且对评估不良反应或自身免疫反应的风险具有重要意义。

小结Siglecs在哺乳动物免疫系统中广泛表达，最近的研究提供了强有力的证据，证明肿瘤源性唾液酸聚糖能够有效地触发这些受体，从而调节TME中不同免疫细胞亚型的功能。唾液酸聚糖－Siglec相互作用显示对效应淋巴细胞的主要抑制作用，同时对骨髓细胞（如单核细胞／巨噬细胞、骨髓间充质干细胞和树突状细胞）表现出更强的调节作用。唾液酸聚糖－Siglec相互作用可能有不同的功能结果，这取决于抑制或激活Siglec家族成员、它们所表达的免疫细胞亚群、肿瘤类型、物种以及TME中其他激活或抑制信号提供的背景。由于TME中的因子可以调节癌细胞中唾液酸聚糖的表达以及免疫细胞亚群上Siglec的表达，因此需要阐明这些因子和调节机制在不同肿瘤类型中的作用，以了解抑制和激活唾液酸聚糖－Siglec相互作用的全部影响。这将是最终设计针对特定癌症的靶向和有效的免疫疗法所必需的。概念验证动物研究已经表明了靶向唾液酸聚糖－Siglec轴的治疗潜力。对TME中唾液酸聚糖－Siglec相互作用的不同功能后果的理解，将有助于完善这些新的治疗策略，为其临床应用铺平道路。

参考文献：

Sialoglycans and Siglecs Can Shape the Tumor Immune Microenvironment． Trends Immunol． 2020 Apr；41（4）：274－285．