小药谈肿瘤免疫之BTN3A1

前言

免疫检查点抑制剂的出现彻底改变了某些癌症的治疗。然而，大多数实体瘤对现有的免疫治疗反应仍然很差，PD－1靶向抗体治疗黑色素瘤和肺癌的成功在其他肿瘤类型中并不常见。虽然大多数免疫治疗方法侧重于增强αβ－T细胞反应，然而仍然有其他具有抗肿瘤潜力的淋巴细胞亚群浸润在肿瘤周围。卵巢癌对单免疫检查点阻断剂无效，在肿瘤中约6％的造血细胞（CD3＋T细胞的20％以上）是γδ－T细胞，其中包括Vγ9Vδ2淋巴细胞，外周血中最丰富的γδ－T细胞。尽管γδ－T细胞可以通过galectin－1而自发地在抗肿瘤上表现出调节活性，但其仍然需要一个强大的驱动力来发挥它们的抗肿瘤活性，以扩大免疫治疗敏感肿瘤的范围。

嗜乳脂蛋白（BTN）和类嗜乳脂蛋白（BTNL）的胞外结构域与共刺激配体B7家族（包括PDL1、B7－H3和B7－H4）在结构上相关。一些BTN和BTNL分子的多态性与炎症性疾病相关，并且有人认为BTN3A家族可以调节抗原特异性αβ－T细胞反应，尽管机制目前还不清楚。最近，人们发现BTN和BTNL分子在调节γδ－T细胞功能中也起着关键作用，而同时发生的BTN3A1－BTN2A1相互作用对于T细胞受体（TCR）依赖的人类Vγ9Vδ2＋T细胞的激活至关重要。在体内，这取决于磷酸化代谢物与B30．2胞内结构域的结合。然而，这些效应可以通过用CD277（BTN3A1－3）特异性抗体稳定BTN3A1的胞外结构域来模拟，这可能是通过BTN3A1的多聚化和自发V形构象的构象变化来完成的。

据此可以推测BTN3A1对αβ－T细胞的抑制作用只发生在其自发构象中，而不需要BTN2A1，并且针对BTN3A1的抗体可以克服αβ－T细胞的抑制，同时诱导γδ－T细胞的抗肿瘤细胞毒性。试验证明，抗CD277的抗体可以将BTN3A1从免疫抑制剂转化为免疫刺激分子，从而动态激发通过协调αβ和γδ－T细胞驱动的抗肿瘤免疫，从而阻止卵巢癌的进展。

αβ－和γδ－T细胞

T细胞表面存在诸多标记，如T细胞受体（TCR）、白细胞分化抗原（CD）等，可根据这些标记将T细胞分为不同类型的亚群。根据T细胞表面TCR的类型，可将T细胞分为αβ－T细胞和γδ－T细胞两类。其中αβ－T细胞即通常所称的T细胞，其表面表达TCRαβ，占T细胞总数的95％以上；而γδ－T细胞表面表达TCRγδ，数量较少，在健康的成年人中，γδ－T细胞占外周血T细胞的1％～ 5％，主要分布于肠道、呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织，是构成表皮内淋巴细胞和黏膜组织上皮内淋巴细胞的主要成分之一。大多数γδ－T细胞为 CD4－CD8－，即其细胞表面不表达CD4和CD8分子，但有少数可表达CD4或CD8，能够参与免疫调节和免疫应答。

根据γδT细胞表面TCR的δ链的表达，可将其分为三个亚群：Vδ1T细胞，Vδ2T细胞和Vδ3T细胞。Vδ1T细胞主要存在于胸腺和黏膜上皮组织中，在外周血中也有少量存在，是黏膜表面最丰富的群落。Vδ1T细胞能分泌许多细胞因子并对肿瘤细胞产生细胞毒效应，在许多疾病中发挥着重要的作用；Vδ2T细胞主要分布在外周血中，占总γδT细胞数量的50％～90％。Vδ2T细胞表面的TCRγδ主要采用Vγ9和Vδ2的配对，能够识别磷酸化抗原而活化，分泌穿孔素、颗粒酶等，产生细胞毒性。激活的Vδ2T细胞可以作为抗原提呈细胞发挥作用。Vδ3T细胞主要分布在肝脏，很少存在于血液中，是机体中数量最少的γδT细胞，仅占0．2％。Vδ3T细胞对靶细胞具有直接杀伤作用，还能够分泌细胞因子。

BTN3A1在侵袭性人类肿瘤中过表达以抑制T细胞活性

通过对42例III／IV期人类高度恶性卵巢癌（HGSOCs）的蛋白裂解物进行了蛋白质印迹分析发现，与良性卵巢肿瘤和正常组织相比，BTN3A1在恶性组织中严重过度表达。在所分析的四种三阴性乳腺癌中，发现一种特定的BTN3A1条带的数量略低，证明BTN3A1的表达并不局限于卵巢恶性肿瘤。

通过对新鲜分离的卵巢癌和乳腺癌细胞的流式细胞术（FACS）分析表明，CD277在髓细胞和肿瘤细胞中高表达，而在淋巴细胞中表达较弱。

对398例其他HGSOCs和19例混合组织学乳腺癌的免疫组化分析证实，BTN3A1普遍表达于肿瘤床，通常定位于上皮细胞内的膜和细胞质。与其免疫抑制作用一致，200例卵巢癌中BTN3A1的平均高表达与患者生存率降低显著相关。对另外13个HGSOC的流式细胞术分析证实，Vγ9Vδ2淋巴细胞占总T细胞的2．5％，γδ－T细胞浸润与改善患者预后相关。

抗CD277抗体阻断了BTN3A1介导的T细胞抑制

CTX－2026是通过酵母展示筛选到的抗BTN3A1的单克隆抗体，采用了糖基化的人IgG1主干，以避免交联、抗体依赖性T细胞毒性和补体激活。同对照相比，CTX－2026和Vγ9Vδ2细胞的激动剂唑来膦酸盐都恢复了BTN3A1依赖的αβ－T细胞的激活。此外，唑来膦酸盐和CTX－2026还增强了对NY－ESO－1转导的、HLA－A2＋BTN3A1＋OVCAR3细胞（NY－OVCAR3）的抗原特异性杀伤作用，并增强了自体肿瘤浸润淋巴细胞从三个HGSOC中清除BTN3A1＋原发癌细胞的细胞毒性。

此外，利用CRISPR在BTN－K32 aAPCs细胞中敲除BTN2A1消除了Vγ9Vδ2 T细胞产生抗体和唑来膦酸盐依赖的干扰素－γ（IFN－γ）的能力。然而，BTN2A1敲除的BTN－K32 aAPC仍保持了其抑制αβ－T细胞激活的能力，表明BTN3A1的αβ免疫抑制和Vγ9Vδ2免疫激活活性之间的转换受BTN2A1信号的调节。

BTN3A1通过阻止CD45从免疫突触分离来抑制T细胞

通过免疫共沉淀发现CD45可能是BTN3A1发挥免疫抑制作用的效应分子。为了验证这一点，试验人员合成了一种CD3ζ－绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，并用于监测在BTN3A1－Fc存在下OKT3诱导TCR触发后CD3ζ－CD45共定位的程度。正如预期，与对照组Fc相比，TCR激活后CD45从CD3ζ分离。表明BTN3A1可能通过阻止CD45与免疫突触的分离而阻断TCR的触发。