酸奶中的益生菌如何与骨外科手术联系在一起？

作为很多人的心头好，酸奶称得上是一种美味、健康兼得的饮品。它不仅保留了牛奶本身的香浓和营养，而且因为经历了发酵过程而拥有酸甜可口、易消化吸收的特点。不仅如此，酸奶中含有的益生菌已被证实有益人体消化系统健康，甚至可以被用于治疗或缓解消化道疾病。

然而，你能想到酸奶还能为改良骨外科手术带来启发吗？

最近，来自湖北大学、天津大学、西安交通大学、北京大学、香港大学和华中科技大学的研究团队从酸奶中的一种益生菌“身上”找到了灵感。

他们通过在钛种植体表面培养干酪乳杆菌得到了菌膜覆盖的改良种植体，并验证了改良种植体具有抵抗致病菌感染、促进骨结合的作用，以及应用于骨外科种植体手术的潜力。相关工作以“Engineered probiotics biofilm enhances osseointegration via immunoregulation and anti－infection”为题，于 11 月 13 日发表在《科学进展》（Science Advances）杂志上。

（来源：Science Advances）

用菌膜改良种植体的设想

那么，问题来了，研究人员是如何将酸奶中的益生菌与骨外科手术联系在一起的？

骨外科手术是修复严重骨折、骨骼畸形的必要方法。骨外科手术中常使用金属种植体（implant）固定损伤的骨骼，来辅助骨骼愈合或维持正常的骨骼形态。种植体在植入人体后需要能够与骨骼形成骨结合（osseointegration），即种植体和骨骼直接接触形成骨组织连接，而之间没有任何其他组织间隔。因此，种植体材料通常为生物相容性好的金属，比如钛和钛合金。

在骨外科种植体手术中，种植体与人体组织连接处的致病菌感染和成骨活性不足是导致手术失败、康复缓慢的两个主要因素，这些情况的发生也会增加医疗成本和患者的病痛。

为解决这两个难题，现有方案通常会使用抗生素类药物或重金属复合抗菌材料（如银锌复合材料），来预防致病菌感染；使用骨肽和生长因子等促成骨药物进行辅助。

然而，这些方案远非最优解：抗生素类药物有破坏人体有益菌群、导致多重感染、产生耐药病菌的风险；重金属具有生物毒性，与种植体生物相容性的要求相悖；而外源添加促成骨因子则需要精细设计和严格配比，使用起来也并不简便。

如果换一种思路，从种植体方面进行改良又如何？

针对前文提出的问题，理想的种植体应该相应地满足两个条件：

（1）具有较高的生物活性，能够促进骨骼组织的生成，使种植体和骨骼可以较快地产生骨结合；

（2）具有抵抗耐药性致病菌感染的能力，能够防止术中和术后感染。

于是，研究人员把目光转向了在医学研究中越来越受到重视的微生物，更具体地说，是已经被广泛用于食品工业中、对人体安全且有益的一类微生物——益生菌。

众所周知，益生菌在人体内扮演着维持消化道健康的重要角色，具有消杀致病菌、调节宿主消化和免疫系统的作用。因此，益生菌被广泛应用于治疗多种消化道疾病，比如炎症性肠道疾病、肠易激综合征、感染性腹泻等。此外，益生菌还能应用于改善炎症性疾病和促进组织再生。

但是，活菌进入血液可能带来菌血症和败血症的风险，所以大部分益生菌必须口服摄入，这给临床应用带来了局限性。

作为“健康三益菌”之一，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei， L． casei）是酸奶中常见的益生菌，在酸奶发酵工业中被广泛使用。它可以产生细菌素、乳酸、过氧化氢等抗菌物质，且对于多种致病菌都展现出了优秀的抗菌性能。同时，它的细胞壁还含有肽聚糖、脂磷壁酸等物质，能够调节人体免疫系统。但是，出于对败血症风险的担忧，此前的研究还未探索过将干酪乳杆菌应用于外科手术的可行性。

种植体植入人体后，会引起异体排斥反应和初步炎症反应。在这个过程中，人体巨噬细胞（Macrophage）会聚集在种植体表面。巨噬细胞的活动对于调节炎症反应和组织再生具有重要作用，它们能够分泌成骨因子，如抑癌蛋白M（oncostatin M， OSM）。成骨因子能诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs）成骨分化，促进骨组织生成、种植体和骨骼产生骨融合。而多糖（如脂多糖）能够激活巨噬细胞表面的相关受体（Toll－like receptor， TLR），使巨噬细胞产生成骨因子。

细菌附着在物体表面，进行繁殖、分化和分泌胞外基质，形成有组织的膜状聚集体，称为“菌膜”（biofilm）。菌膜主要由细菌和其周围的胞外聚合物（extracellular polymeric substance， EPS）基质组成，而干酪乳杆菌的细胞壁和EPS中都含有脂多糖。

研究者们设想，在种植体表面覆盖一层干酪乳杆菌菌膜进行改良，植入后巨噬细胞聚集在种植体周围，而种植体表面的菌膜中含有的多糖就可以刺激巨噬细胞产生成骨因子，促进骨融合。

图 ｜ 主要实验设想（来源：Science Advances）

在种植体表面覆盖一层干酪乳杆菌菌膜，在安全无害的同时，还应该具有抗耐药性致病菌和促进骨结合的功能。这正是改良种植体、解决手术难题的可能方案。

为种植体“镀”上一层安全菌膜

研究人员用碱热处理的钛（AHT－Ti）种植体作为培养基质，在其表面培养干酪乳杆菌，培养时长为3天，使种植体表面覆盖干酪乳杆菌菌膜。碱热处理的作用是使钛种植体表面生物活性增加，利于生物细胞的黏附和增殖，促进菌膜的形成和种植体骨结合，即“活化”。

如何解决活细菌进入血液导致败血症的风险呢？研究人员对覆盖菌膜的种植体进行了短时间紫外线辐射灭活，在杀死细菌的同时保留了菌膜中的活性物质。对灭活后的菌膜进行活性检验染色（活菌呈绿色，死菌呈红色），染色后的菌膜呈现红色荧光（如下图C），说明菌膜中的细菌被成功灭活。

通过这种方式，研究人员成功得到了干酪乳杆菌菌膜覆盖的活化钛种植体（L． casei－AHT－Ti）。

图 ｜ L． casei－AHT－Ti的表面（来源：Science Advances）

此外，为验证菌膜是否“不惧”耐药性致病菌，研究人员选用了目前临床手术中常见的广谱耐药性致病菌——耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）进行了测试。

实验用未活化的钛种植体、碱热处理活化的钛种植体作为活化钛种植体的两个对照组。在三组种植体上分别接种MRSA进行培养，每2个小时测量一次菌液的光密度（optical density， OD），共培养12小时。用得到的数据绘制OD曲线（如下图E）。

图 ｜ 抗MRSA性能测试（来源：Science Advances）

OD数值越大，菌液中细菌浓度越高、数量越多，说明MRSA增殖越活跃，种植体样本的抗致病菌性能越差。从OD曲线图中可以看出，在12小时的培养过程中，活化钛种植体的OD曲线明显低于钛种植体、碱热处理活化的钛种植体，这说明活化钛种植体在抑制MRSA的能力方面表现更佳。在后续的涂布平板实验中，活化钛种植体的MRSA菌落数量更是比其他两者减少了三个数量级，抗MRSA的效率达到了惊人的99．98％。

但是，从图F又可以看出，菌膜培养时间为1天和2天的碱热处理钛种植体（L． casei－AHT－Ti－1、L． casei－AHT－Ti－2）相比于菌膜培养时间为3天的L． casei－AHT－Ti抗菌性能明显下降。研究人员检测了菌膜中抗菌活性物质乳酸（Lactic acid）和过氧化氢（H2O2）的含量，发现乳酸含量有明显的减少。通过SDS－PAGE检测抗菌活性物质细菌素（bacteriocin）的分泌量，发现L． casei－AHT－Ti最高。根据这些结果推测，乳酸和细菌素可能是L． casei－AHT－Ti发挥抗菌性能的主要功能物质。

“唤醒”巨噬细胞、“推进”成骨分化

为验证L． casei－AHT－Ti是否有激活巨噬细胞（Macrophage）的性能，研究人员进行了多项实验。

研究人员首先对三组种植体样本表面的巨噬细胞进行DAPI（呈蓝色）和FITC－phalloidin（呈红色）染色，以观察种植体表面分布的巨噬细胞的形态和生存能力（如下图A、B），。结果显示，L． casei－AHT－Ti表面的巨噬细胞与对照组相比无明显差异，这说明L． casei－AHT－Ti对巨噬细胞没有毒性。

之后，研究人员用RT－PCR分别检测了三组种植体样本表面巨噬细胞的成骨因子OSM、促炎症因子TNF－α、抑炎症因子IL－10的表达量（如下图C、D、E）。OSM、TNF－α、IL－10能诱导间充质干细胞和成骨细胞的骨性分化。可以发现，L． casei－AHT－Ti表面巨噬细胞表达OSM、TNF－α、IL－10相比对照组都有明显增多。由此可以推测，L． casei－AHT－Ti可能具有激活巨噬细胞分泌成骨过程相关细胞因子的作用。

图 ｜ 激活巨噬细胞性能测试（来源：Science Advances）

除此之外，研究人员还发现L． casei－AHT－Ti表面巨噬细胞的多个成骨细胞分化相关基因表达上调（如下图B、C），其中包括能与菌膜中的多糖结合激活巨噬细胞的脂多糖受体CD14，与巨噬细胞生产OSM相关的COX2、PGE2、EPR，以及调控炎症反应的IL－1b、IL－6、TNF－α、IL－10。

据此，研究人员提出了L． casei－AHT－Ti激活巨噬细胞、促进骨生成的完整过程（下图D）：干酪乳杆菌菌膜与巨噬细胞接触，菌膜中的脂多糖与巨噬细胞膜上的CD14结合，激活TLR，促使巨噬细胞产生促炎症因子IL－1b、IL－6、TNF－α和生产OSM相关的COX2、PGE2、EPR，促进初步炎症反应和成骨因子OSM的生成，刺激成骨细胞分化。

图 ｜ 促使巨噬细胞产生骨诱导细胞因子（来源：Science Advances）

成骨因子的分泌量增加后，能否成功诱导间充质干细胞骨性分化？为了验证这一点，研究人员用三组样本的巨噬细胞培养溶液分别对间充质干细胞进行孵育，成功证明了L． casei－AHT－Ti能够在体外实验条件下增加间充质干细胞成骨分化。

具备应用于骨外科手术的潜力

但是，要想证明L． casei－AHT－Ti有应用于骨外科手术的潜力，仅有体外实验作为支持是不够的。于是，研究人员用大鼠进行了每组样本量为3的体内实验，他们给胫骨骨折的大鼠分别手术植入了三种种植体，并添加了一组在术中在种植处添加MRSA的实验，以检验大鼠体内条件下不同种植体的骨结合和抗致病菌性能。

实验结果表明，在体内条件下，L． casei－AHT－Ti也展现出比两组对照种植体更优的性能。

在添加MRSA的术后12小时进行的涂布平板实验中，L． casei－AHT－Ti相比于Ti的抗MRSA效率为98．1％，；根据无菌条件术后4周进行的三维显微CT计算骨体积分数（BV／TV），以及根据VG固定染色计算骨面积比率（bone area ratio），L． casei－AHT－Ti的数值都显著高于两组对照种植体。这些结果证明了，L． casei－AHT－Ti在体内实验条件下具有抵抗致病菌感染和促进骨生成、骨结合的性能。

以上结果表明，L． casei－AHT－Ti在体外和大鼠体内都具有抗耐药性致病菌MRSA和激活巨噬细胞、促进成骨分化和骨结合的作用。用干酪乳杆菌菌膜改良钛种植体的成功尝试，为骨外科手术提供了一条安全性高、富有潜力的新思路。

那么，你是否看好酸奶益生菌这样“硬核”的打开方式？