如何用超分辨显微镜观察染色质？

“纠缠”在一起的DNA被压缩在细胞核内，想对核内复杂的环境进行观察是个困难的事情，整理分享一篇用超分辨显微镜观察染色质的文章，具体内容如下：

细胞核内DNA并不独立自由的存在，而是以特定的方式压缩：DNA缠绕组蛋白形成核小体（nucleosome）；串联的核小体进一步压缩成染色质（chromatin）；细胞分离时，染色质会压缩成染色体

用核酸染料（SYTOX Green或DAPI）对核内进行染色，SIM超分辨进行观察，发现核内DNA呈海绵状，有的地方DNA密集（白色区域），有的地方没有DNA（黑色），作者将DNA密集区定义为CD（chromatin domain染色质区域），将没有DNA的黑色区域定义为IC（inter－chromatin compartment 染色质间隙），IC与核孔相连

染完DNA“染”组蛋白用于反映染色质：DNA和组蛋白共定位；除了在固定细胞上看染色质，为了排除固定对细胞核状态的影响，又在活细胞上看了染色质状态 – 依然是IC与CD黑白相间的海绵状

进一步用EU掺入法标记出RNA，发现RNA和DNA“互斥”，暗示RNA分布在IC区

超分辨看完又用电镜看细胞核内染色质（和SIM想法，在电镜图上黑色反映高密度区，黑色的是染色质）

对电镜图进行分析，发现电镜图和SIM图观察出的染色质状态一致

作者以“麻麻咧咧”的细胞核SIM超分图为根据地，观察各种已知的变量在CD区和IC区的分布，首先是看TAD（topologically associating domains）：TAD是染色质折叠出的空间结构，通过测序技术3C／Hi－C，能找到DNA片段上相关序列

首先看了一个已知的在X染色体上的TAD位点，FISH标定出了TAD（红色点），分析TAD和CD空间关系发现两者相邻、严密契合

看其他TAD，依然是分布在CD区周围

接下来作者看了各种组蛋白修饰、染色质结构相关蛋白、RNA相关蛋白在CD或IC的分布。首先，作者自己制定了一套量化标准，根据蛋白在IC－CD之间的分布情况分为7级：在IC定义为1，在CD定义为7

可见异染色质、沉默基因相关组蛋白分布在CD区，离IC区较远；活动的基因、RNA相关蛋白、染色质结构相关蛋白分布在CD区外。和这些蛋白、基因的行为一致，活动性差的就在比较紧密的CD区内，不对外开放；活动性强的则在紧密的CD区外，便于实现相关功能 － 说白了就是看图说话，数据展示用热图，这样比较炫酷

再进一步，作者还发现，在CD区或离CD区越近（如紫色标记的6级），分子量越小 – CD区比较紧密，需要“瘦小的身材” – 充分发散故事，增加文章丰富性

CD和IS一个很大的区别在于紧密度，CD区很致密，作者选了一个致密的DNA需要打开的情景 – 细胞周期中需要进行DNA复制的S期：EdU会掺入正在复制的DNA，可见S期早期EdU主要分布在CD区外，随着S期进展，到S期晚期，CD区内EdU增加

致密的CD区由压缩的染色质折叠而成，CTCF和cohesin调节染色质的折叠、DNA loop挤出（如左图），作者做了一个可诱导敲除cohesin亚单位RAD21的细胞系，想看看敲掉调节染色质折叠的蛋白RAD21后CD和IS的变化

可以看到，敲掉RAD21后，CD、IS分布并未受到影响，组蛋白的分布、量也没发生变化，暗示染色质3D结构、表观层面没发生显著变化，并不依赖cohesin

作者主要关注的是致密的染色质组成的CD区，SIM和电镜图向我们展示了CD区。为了便于和电镜图比对，SIM图颜色做了反转，本该是白色有强荧光信号的CD区成了黑色，能看到，两项技术对CD区的呈现类似，电镜由于分辨率更高，让我们看到了CD区内的细节。基于前面的数据，能推出致密的CD区处于抑制状态，CD区周围活动着各种DNA、RNA相关事件，如复制、转录，在DNA复制时，致密的CD区会“打开”

文章真的一点也不复杂，核酸染料染个细胞核，再加几个抗体染蛋白，而后就是拍片子。电镜用于锦上添花，不需要太多图，关键在于会讲故事、会呈现数据……

Ezequiel Miron， Roel Oldenkamp， Jill M． Brown， David M． S． Pinto， C． Shan Xu， et al． Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin ［J］ Science advances， 23 September 2020．

参考文献：

Weimin Wang， Michael Green， Jae Eun Choi， Miguel Gijón， Paul D． Kennedy， et al． CD8＋ T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapy ［J］．Nature， 2019．