固体废物 二噁英类的筛查 报告基因法(征求意见稿)

固废网讯:环保网获悉，为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国固体废物污染环境防治法》，保护环境，保障人体健康，规范固体废物中二噁英的筛查方法，生态环境部印发《固体废物 二噁英类的筛查 报告基因法(征求意见稿)》，详情如下：

前 言

为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国固体废物污染环境防治法》，保护环境，保障人体健康，规范固体废物中二噁英的筛查方法，制定本标准。

本标准规定了筛查固体废物中二噁英类的报告基因法。本标准的附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。本标准为首次发布。

本标准由环境监测司、科技标准司组织制订。本标准起草单位：国家环境分析测试中心。

本标准验证单位：河南省环境监测中心站、中国农业科学院、湖南省环境监测中心站、广西壮族自治区环境保护监测中心站、四川省环境保护科学研究院和宁波市环境监测中心。

本标准生态环境部20□□年□□月□□日批准。本标准自20口□年□□月□□日起实施。

本标准由生态环境部解释。

固体废物 二噁英类的筛查 报告基因法

警告：操作人员应了解二噁英类分析操作的相关风险，并接受相关培训。实验中所使用的溶剂及标准样品均为有毒有害化合物，其溶液配制应在通风柜中进行，操作时应按规定要求佩戴防护器具，避免接触皮肤和衣物。

1 适用范围

本标准规定了筛查固体废物中二噁英类化合物的报告基因法。本标准适用于固体废物中二噁英类化合物的筛查。

标准溶液的检出限和测定下限根据使用细胞的不同而异。当使用 H1L6.1c2 细胞时，标准溶液的检出限为 0.980 pg-TEQ/ml(0.200 pg-TEQ/well)，测定下限为 1.96 pg-TEQ/ml(0.400 pg-TEQ/well)，当取样量为 3.5 g 时，方法测定下限为 1.00 pg-TEQ/g。

2 规范性引用文件

本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。

HJ 77.3 固体废物 二噁英类的测定 同位素稀释高分辨气相色谱-高分辨质谱法

HJ/T 20 工业固体废物采样制样技术规范 HJ/T 298 危险废物鉴别技术规范

3 术语和定义

3.1 二 噁 英 类 polychlorinated dibenzodioxins (PCDDs) and polychlorinated dibenzofurans (PCDFs)

指多氯代二苯并-对-二噁英(PCDDs)和多氯代二苯并呋喃(PCDFs)的统称。

3.2 芳香烃受体 arylhydrocarbon receptor

指一种配体激活的转录因子，其配体为二噁英类等多环芳烃，也可简称为 Ah 受体或 AhR。

3.3 报告基因 reporter gene

指一种位于启动子下游，编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物可以定量测定。

3.4 二噁英应答序列 dioxin responsive element (DRE)

指位于基因上的一段碱基序列。AhR 与配体结合后进入细胞核，与核转录因子接合形成复合体，DRE 可以与该复合体特异性识别并结合。

3.5 荧光素酶 luciferase

自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的为萤火虫的萤光素酶。

3.6 传代培养 subculture

指将冻存细胞或培养细胞的一部分，接种到新鲜培养基中继续培养的操作。

3.7 复苏 initial culture

指将冻存的细胞从冻存的容器中取出进行培养的操作。

3.8 相对发光量 relative light unit (RLU)

样品中的二噁英与基质反应后发光，发光强度经仪器检测后所呈现出的数值。

3.9 标准物质的检出限 limits of detection

生物检测法中，用标准物质制作标准曲线后，利用标准曲线计算能够检测出的最小标准物质的浓度。

3.10 标准物质的测定下限 limits of quantitation

生物检测法中，用标准物质制作标准曲线后，利用标准曲线计算能够定量的最小标准物质的浓度。

4 方法原理

利用荧光素酶转基因重组细胞与二噁英类及芳香烃受体(AhR)结合的特性，通过测定荧光素酶活性求得样品中二噁英类总量。该系统合成的荧光素量以及荧光强度与测试系统加入的二噁英类物质的量成正比。

5 干扰和消除

在本方法规定的条件下，其他有机物可能会产生干扰。可通过优化净化步骤，例如增加硫酸处理步骤或者采用多种净化步骤去除干扰。

6 试剂和材料

除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的农残级试剂。实验用水为正己烷充分洗涤过的蒸馏水，与细胞培养相关的水必须是灭菌后的超纯水。

6.1 甲醇(CH3OH)。

6.2 丙酮(C3H6O)。

6.3 甲苯(C7H8)。

6.4 正己烷(C6H14)。

6.5 二氯甲烷(CH2Cl2)。

6.6 壬烷(C9H20)或癸烷(C10H22)。

6.7 二甲基亚砜(C2H6OS)(DMSO)：细胞培养级别。

6.8 乙酸乙酯(C4H8O2)。

6.9 异丙醇(C3H8O)：分析纯。

6.10 盐酸：ρ(HCl)=1.19 g/ml，优级纯。

6.11 硫酸：ρ(H2SO4)=1.84 g/ml，优级纯。

6.12二噁英类多氯联苯淋洗液(DL-PCBs)：将甲苯(6.3)、乙酸乙酯(6.8)、正己烷(6.4)按照体积比为 1:1:8 的比例配制而成的溶液。

6.13 基础培养基：主要包括 199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DMEM/F12 等。主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。

6.14 青霉素/链霉素混合溶液：3 mg/ml 青霉素和 5 mg/ml 链霉素的混合溶液。使用前经过滤灭菌以及内毒素测试，0°C 以下冷冻保存。

6.15 胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)：使用前在 56°C 下，经过 30 min 非动化处理，-20°C 冷冻保存。

6.16 培养基：将青霉素/链霉素混合溶液(6.14)、胎牛血清(6.15)、基础培养基(6.13)等按照一定体积比配制成的细胞培养液，例如：1:10:100。

6.17 胰蛋白酶溶液(trypsin)：含量 0.25%，0°C 以下冷冻保存。

6.18 磷酸盐缓冲溶液(PBS)：不含钙、镁的 PH 值为 7.6 的磷酸盐缓冲溶液。

6.19 细胞冻存液：用于保存细胞的溶液。

用二甲基亚砜(6.7)和胎牛血清(6.15)按 1:9 体积比混合配制，亦可购买市售有证产品。

6.20 细胞裂解液：可将细胞质内蛋白完全提取出的溶液。

6.21 荧光素溶液：在荧光素酶作用下，可以发出荧光的物质的统称。

6.22 二氧化碳(CO2)：纯度≥99.99%。

6.23 液氮：纯度≥99.999%。

6.24 2,3,7,8-TCDD 标准溶液：浓度为 32 pg/µl，溶剂为甲苯或者 DMSO。

6.25 无水硫酸钠(Na2SO4)：分析纯。

380°C 加热处理 4 h，密封保存。

6.26 氢氧化钾(KOH)：优级纯。

6.27 硝酸银(AgNO3)：优级纯。

6.28 硅藻土(celite 545)：二氧化硅含量≥89%，平均粒径≤125.3 µm，900℃下热灼减率≤0.3%。

6.29 石英砂：二氧化硅含量≥98%，粒径 100 目~40 目，盐酸可溶率≤3.0%。