铁离子对厌氧氨氧化污泥富集培养的影响

厌氧氨氧化菌的富集培养是限制该工艺的关键因素，文章通过对照试验考察了铁离子对厌氧氨氧化污泥富集培养的影响，并采用定量PCR及16SrRNA高通量测序技术分析其机理，研究结果对厌氧氨氧化污泥的富集培养及工艺的启动具有参考价值和指导意义。该文试验数据充分，理论分析合理，撰写规范，较好地表达了研究过程和结果，研究成果具有理论意义和实用价值。

本研究通过对照试验考察了铁离子对厌氧氨氧化污泥富集培养的影响，并采用荧光定量PCR及16SrRNA高通量测序技术从微生物生态学解析其机理，研究结果对厌氧氨氧化污泥的富集培养及工艺启动具有参考价值和指导意义。

1、材料与方法

1.1、试验装置与运行条件

试验采用小试规模厌氧颗粒污泥膨胀床反应器（expanded granular sludge bed,EGSB），由有机玻璃制作，有效容积为0.8L，外覆锡纸以隔绝光的影响。反应器运行温度通过恒温循环水槽维持在35℃，进水pH值用0.1mmol/L盐酸调节为6.6~6.8，以保证Fe(Ⅲ)的溶解；本试验采用连续流，水力停留时间（HRT）为24h，试验装置如图1所示。

1.2、接种污泥与模拟废水

试验所用接种污泥取自南京某市政污水厂氧化沟缺氧段，为棕黄色絮状污泥。反应器接种污泥量为20g/L，接种前用pH值=7.2的磷酸盐缓冲液冲洗三次，以洗去残余物质。模拟废水以自来水配置，组分为：(NH4)2SO4(按需配制)、NaNO2(按需配制)、KH2PO410mg/L、CaCl2˙2H2O5.6mg/L、MgSO4˙7H2O300mg/L、KHCO3500mg/L、EDTA25mg/L、微量元素浓缩液Ⅰ1.25mL/L、微量元素浓缩液Ⅱ(按需配制)。微量元素浓缩液Ⅰ组分为：FeSO40.625mL/L、H3BO40.0175mL/L、MnCl2˙4H2O1.2375mL/L、CuSO4˙5H2O0.3125mL/L、ZnSO4˙7H2O0.5375mL/L、NiCl2˙6H2O0.2375mL/L、NaSeO4˙10H2O0.2625mL/L、NaMoO4˙2H2O0.275mL/L。

微量元素浓缩液Ⅱ：FeCl3(按需配制)，R1为控制组，模拟废水中不添加微量元素浓度液Ⅱ；而试验组R2、R3中添加微量元素浓缩液Ⅱ并控制Fe(Ⅲ)浓度分别为0.04、0.08mmol/L。模拟废水预曝高纯氮气(>99.5%)至溶解氧浓度(DO)低于0.5mg/L，再泵入反应器中。

1.3、常规指标分析方法

反应器出水定期采样，经0.22μm滤膜过滤后测定，分析测定方法参考国家标准。NH4+-N采用水杨酸分光光度法；NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法；NO3--N采用酚二磺酸分光光度法；Fe(Ⅲ)采用邻菲啰啉光光度法；溶解氧(DO)以便携式溶解氧仪测定，pH值由pH计测定。

1.4、污泥粒径分析

从反应器中取一定量污泥至50mL离心管中，置于激光粒度仪（Mastersizer3000，英国马尔文仪器有限公司）中检测。样品充分混匀后，以水为分散剂进行分析测试，并使用机器配置的软件进行记录，使用一次性塑料滴灌吸取搅拌均匀的样品，污泥样加至遮光度在10%~15%时进行测试。单一样品重复测定三次，以降低误差。

1.5、实时荧光定量PCR分析

污泥样品采用FastDNASPINKitforsoil试剂盒提取污泥DNA，而后用NanoDrop2000超微量紫外分光光度计定量，采用SYBR®Green染料法进行定量PCR分析。选取目标基因包括：细菌16SrRNA基因、厌氧氨氧化菌16SrRNA基因及部分氮素转化功能基因，以含有目标基因的质粒标准品建立标准曲线（R2>0.999）。扩增体系为25μL，含12.5μL2×SYBR®GreenPCRMasterMix（Vazyme，中国），2μL模板DNA（20ng/μL），正反引物各0.2μL，10.1μL无菌超纯水；扩增程序在荧光定量PCR仪AB7500（LifeTechnologies,美国）进行，每个样品做三个平行，具体参数如表1所示。

表1目标基因的引物序列及退火温度

1.6、16SrRNA高通量测序分析

16SrRNA高通量测序分析基于IlluminaMiseq测序平台，具体步骤包括DNA提取、PCR扩增、产物验证及纯化、测序及结果分析。DNA提取见1.5，PCR扩增采用细菌通用引物，引物序列为：正向引物(5’-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’)，反向引物(5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’)；扩增体系为50μL，含5μL10×PCRBuffer(TaKaRa，日本)、0.25μLExTaqDNA聚合酶、4μLMgCl2、4μLDNTPMixture、2μLDNA模板（20ng/μL）、正反引物各1μL，无菌超纯水若干。

扩增反应于VeritiPCR仪（LifeTechnologies，美国）进行，扩增程序为：预变性98℃/5min，扩增循环20次（变性98℃/30s，退火50℃/30s，延伸72℃/40s），延伸72℃/10min。扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳验证，经E.Z.N.A.TMCycle-PureKit试剂盒纯化后，送至江苏中宜金大分析检测有限公司进行测序分析。测序数据使用Sickle和Mothur程序降噪处理，而后用RDPclassifier对序列分类，使用Heml程序绘制热图。

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